用于检测蛋白质的变构调节剂的方法技术

本发明专利技术尤其公开了使用SHG活性探针标记靶蛋白，以用于通过二次谐波产生或和频产生进行检测，以便鉴别与靶蛋白上的变构位点结合从而改变其结构构象的试剂的方法。

【技术实现步骤摘要】
本申请是2013年04月25日提交的专利技术名称为“用于检测蛋白质的变构调节剂的方法”的第201380033299.4号(国际申请号PCT/US2013/000117)中国专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请是2013年3月11日提交的美国申请No.13/794,277的部分继续申请，并根据35U.S.C.§119(e)要求2012年4月25日提交的美国申请No.61/638,131的权益。本申请还要求2012年11月2日提交的PCT专利申请No.PCT/US2012/063286的优先权，该PCT专利申请又根据35U.S.C.§119(e)要求2012年4月25日提交的美国临时专利申请No.61/638,026的权益。上述申请为了所有目的通过引用并入本文。
本专利技术涉及分子检测领域并且特别涉及蛋白质检测领域。具体地，本文提供了使用二次谐波产生(secondharmonicgeneration)技术鉴别和检测靶蛋白的变构调节剂的方法。
技术介绍
随着对癌症基因组学的认识的进步，在癌症生物学中潜在的治疗靶标的数目在过去二十年呈指数式增长。然而，与此同时，获准的针对最丰富地活化的癌症相关基因的疗法的数目仅略有增长。从化学的角度来看，许多从生物学角度来看具有吸引力的癌症靶标被认为是难治性的(“不可成药的(undruggable)”)。人们越来越认识到，这些蛋白质靶标并不适于传统的药物发现方法，通常这是因为它们在与其他蛋白质相互作用(即，蛋白质-蛋白质相互作用或“PPI”)时具有相对较大的接触面积，或者是由于它们具有极其紧密地与蛋白质的活性位点结合的配体。后一种情况的实例在例如Ras的蛋白质中发现，Ras以皮摩尔的亲和力结合其配体GTP，使得与潜在药物的竞争变得困难。据估计，全部现有靶标中的75-80％是传统的小分子或生物(蛋白质)类治疗剂所无法企及的，这些治疗剂通常通过竞争性结合蛋白质的活性位点来抑制蛋白质功能，在这些靶标中有许多针对癌症充分验证的靶标。此类“不可成药的”靶标的变构调节剂提供了一种具有吸引力的治疗方案。根据定义，变构分子与除蛋白质的活性位点以外的位点结合，从而改变蛋白质的构象并伴随有功能效应(例如，受体的抑制、活化等)。此外，在其他优势中(1)，靶蛋白的变构调节还具有以下额外的优势：不必依赖于对天然配体与蛋白质结合的抑制或竞争，其可能导致不期望的临床副作用。然而，难以通过当前可用的常规技术来鉴别变构调节剂。例如，由X射线晶体学或NMR法获得的结构信息由于低通量、低灵敏度、非生理性条件、适于该技术的蛋白质的大小以及许多其他因素而在用于药物发现的目的时受到限制。因此，所需要的是能够快速且以高通量的方式鉴别对靶蛋白的结构进行变构调节的试剂(agent)的技术。本文通过公开用于鉴别能够与靶蛋白进行变构结合从而改变其构象结构的试剂的方法而提供了这样的技术。在整个说明书中，引用了多个专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章)。本文所引用的所有专利、专利申请和出版物的公开内容为了所有目的通过引用整体并入本文。
技术实现思路
本文提供的专利技术尤其公开了通过使用二次谐波产生技术来鉴别和检测靶蛋白构象状态的变构调节剂的方法。因此，在一些方面，本文提供了一种用于鉴别与靶蛋白上的变构位点结合的试剂B的方法，该方法包括：(a)使靶蛋白与结合靶蛋白的活性位点的试剂A接触；(b)使靶蛋白与试剂B接触，其中靶蛋白采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分(例如，标记物)进行标记，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分(例如，标记物)产生可检测信号，并且其中所述可检测信号指示在试剂B与靶蛋白上的变构位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；以及(c)测定靶蛋白与试剂B接触后所述可检测信号的存在或不存在。在一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)选自PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰亚胺酯、BADANTM(6-溴乙酰基-2-二甲基氨基萘)和ACRYLODANTM(6-丙烯酰基-2-二甲基氨基萘)。在一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)通过靶蛋白表面上的一个或多个巯基基团与靶蛋白结合。在一些实施方案中，所述一个或多个巯基基团是天然的巯基基团。在一些实施方案中，所述一个或多个巯基基团是工程化的巯基基团。在一些实施方案中，所述一个或多个巯基基团位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白氨基酸残基上。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)是PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)。在一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)通过靶蛋白表面上的一个或多个胺基团与靶蛋白结合。在一些实施方案中，所述一个或多个胺基团是天然的胺基团。在一些实施方案中，所述一个或多个胺基团是工程化的胺基团。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述一个或多个胺基团位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白氨基酸残基上。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)是PyMPO-琥珀酰亚胺酯。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述靶蛋白在与表面结合时被原位标记。在一些实施方案中，所述二次谐波活性部分(例如，标记物)是非天然氨基酸。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸位于已知与一个或多个配体接触的靶蛋白的区域内。在一些实施方案中，所述非天然氨基酸是Aladan。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述配体为蛋白质、核酸、磷脂、碳水化合物或辅因子中的一种或多种。在一些实施方案中，所述配体是激酶信号级联的蛋白质成员。在一些实施方案中，所述靶蛋白是G蛋白偶联受体、类固醇激素受体或酪氨酸激酶受体。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述界面选自：玻璃表面、聚乙二醇表面、支持的脂双层表面、脂质类似物双层表面、塑料表面、金属表面、胶乳表面、橡胶表面、陶瓷表面、聚合物表面、聚丙烯表面、聚偏二氟乙烯表面、聚乙烯表面。在一些实施方案中，使用寡聚PEG(oligo-PEG)分子或脂质对表面进行衍生化。在一些实施方案中，所述寡聚PEG分子或脂质是带有Ni-NTA的寡聚PEG分子或带有Ni-NTA的脂质。在一些实施方案中，所述表面是支持的脂双层或脂质类似物双层。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，所述靶蛋白包含亲和标签。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，实时检测靶蛋白结构的构象变化。在本文所述的任何实施方案中的一些实施方案中，试剂A和/或试剂B是小分子化学化合物、抗体、非抗体多肽、碳水化合物、抑制性核酸或它们的任意组合。在一些方面，本文提供了一种用于鉴别在与试剂结合时经历构象变化的靶蛋白结构中的特异性位点的方法，该方法包括：(a)使靶蛋白与试剂接触，其中靶蛋白在第一氨基酸残基处采用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分(例如，标记物)进行标记，其中，采用表面选择性技术由二次谐波活性部分(例如，标记物)产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别与靶蛋白上的变构位点结合的试剂B的方法，该方法包括：a.使靶蛋白与试剂A接触，试剂A与靶蛋白的活性位点结合，或者其中试剂A在被分离时与靶蛋白的活性位点天然结合；以及b.使靶蛋白与试剂B接触，其中用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分标记靶蛋白，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生可检测信号，并且其中所述可检测信号指示在试剂B与靶蛋白上的变构位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；以及c.测定靶蛋白与试剂B接触后所述可检测信号的存在或不存在。

【技术特征摘要】
2012.04.25 US 61/638,131;2012.04.25 US 61/638,026;1.一种用于鉴别与靶蛋白上的变构位点结合的试剂B的方法，该方法包括：a.使靶蛋白与试剂A接触，试剂A与靶蛋白的活性位点结合，或者其中试剂A在被分离时与靶蛋白的活性位点天然结合；以及b.使靶蛋白与试剂B接触，其中用在界面处具有净取向的二次谐波活性部分标记靶蛋白，其中采用表面选择性技术由二次谐波活性部分产生可检测信号，并且其中所述可检测信号指示在试剂B与靶蛋白上的变构位点结合时所产生的靶蛋白结构的构象变化；以及c.测定靶蛋白与试剂B接触后所述可检测信号的存在或不存在。2.如权利要求1所述的方法，其中所述二次谐波活性部分选自PyMPO-MALEIMIDETM(1-(2-马来酰亚胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓甲磺酸盐)、PyMPO-NHS、PyMPO-琥珀酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：约书亚·S·萨拉夫斯基，
申请(专利权)人：比奥德赛公司，
类型：发明
国别省市：美国;US