大肠杆菌石墨烯量子点免疫荧光探针溶液制备及检测方法技术

本发明专利技术公开了大肠杆菌石墨烯量子点免疫荧光探针溶液检测方法，首先配制BSA、EDC和NHS的PBS溶液，并将EDC溶液滴入石墨烯量子点的溶液中充分反应后，滴入NHS溶液，再加入PBS形成溶液A；将大肠杆菌O157:H7抗体溶于PBS形成溶液B；将溶液A与B混合并滴入适量BSA溶液，摇晃反应形成石墨烯量子点免疫荧光探针溶液C。将探针溶液与菌液混匀，然后孵育、洗脱、制片，于荧光显微镜下观察，通过样本是否发荧光、荧光强度情况、发光菌种数量等信息判断菌液中是否含有大肠杆菌O157:H7及其含量多少。本发明专利技术采用免疫荧光探针来检测肠出血性大肠杆菌O157:H7，该检测方法具有操作简单，耗时少，重现性好，灵敏度高，特异性好，对设备要求低等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物免疫荧光检测领域，特别是一种肠出血性大肠杆菌O157:H7的量子点快速免疫荧光检测。
技术介绍
肠出血性大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)主要包括O157:H7、O26:H11、O111和O140等几种血清型，其中O157:H7是典型菌株，人若感染该病原菌十个以上，即可引起腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症及血栓性血小板减少紫癜等严重并发症，严重者可导致死亡。且E.coli157:H7的感染具有暴发流行、强致病性、高致死率及抗生素治疗可能加剧病情等特点。因此，建立E.coli157:H7快速、特异和灵敏的检测方法，对于及时有效地采取预防和治疗措施十分必要。传统的检测方法有平板计数法与多管发酵法，操作繁琐，检测周期长。聚合酶链式反应(PCR)技术的推广与应用，极大提高了E.coli的检测灵敏度与效率，但由于仪器价格昂贵，操作过程复杂，不利于现场快速、便捷的检测。基于纳米荧光材料的荧光抗体技术在E.coliOl57：H7的高灵敏检测方面已有报道，但由于使用的荧光标记物CdSe等含有毒的重金属元素，其对环境和健康危害不容忽视。石墨烯量子点(Graphenequantumdots，简称GQDs)，具有独特的量子效应、拥有丰富的边界缺陷，在各种溶剂中呈现出优异的分散性能。表面经过有机物钝化处理的石墨烯纳米颗粒，是一种有机无机杂化纳米材料，具有与传统量子点(QDs)媲美的荧光性能，同时因其本身不含任何有毒重金属元素，具备优异的环境友好性和生物相容性，且易于表面功能化修饰，一经发现便引起了人们广泛的研究兴趣。纵观国内外有关GQDs应用的研究报道，主要集中在细胞成像、靶向示踪、光电器件、多价金属离子及蛋白质检测，然而关于GQDs基免疫荧光探针的构建及其在病毒、细菌等微生物的快速检测方面的研究目前尚未见报道。因此，基于GQDs的E.coliO157：H7免疫荧光探针的制备方法并建立相应的检测方法至关重要。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种GQDs-大肠杆菌抗体免疫荧光探针的制备方法，该探针能提供一种快速、特异性检测E.coliOl57：H7的方法，该检测方法用于食品、药物、生物体等里面E.coliOl57：H7的检测。本专利技术的目的是通过这样的技术方案实现的：本专利技术提供的一种肠出血性大肠杆菌的石墨烯量子点免疫荧光探针溶液制备方法，包括以下步骤：S1：按比例称取BSA、EDC和NHS，分别溶于2-6mL的0.01M，pH7.4的PBS缓冲液中，得到EDC的PBS溶液和NHS溶液的PBS溶液；S2：将EDC的PBS溶液滴加入石墨烯量子点的溶液中充分反应形成GQDs溶液；S3：将NHS的PBS溶液滴入GQDs溶液中，再加入PBS缓冲液中形成溶液A；S4：将大肠杆菌抗体溶于PBS缓冲液中，形成溶液B；S5：将溶液A与溶液B混合，并滴入适量的BSA的PBS溶液，反应形成量子点免疫荧光探针溶液C。进一步，所述步骤S2中将EDC溶液缓慢滴加入石墨烯量子点的溶液后，反应的温度是36-37.5℃，反应时间为10-15min。进一步，所述步骤S4中溶于PBS溶液的大肠杆菌O157:H7抗体的用量是10-30μL。进一步，所述步骤S5中溶液A和溶液B的用量均为200-400μL，摇晃反应的温度条件为36-37.5℃，反应的时间为40-90min。进一步，所述NHS溶液为N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐中的一种。进一步，所述石墨烯量子点为氨基化石墨烯量子点、羧基化石墨烯量子点和氮石墨烯量子点中的一种；所述菌液为来自食品、药品和生物体内的菌液；所述肠出血性大肠杆菌为E.coliOl57：H7。本专利技术提供的一种肠出血性大肠杆菌的石墨烯量子点免疫荧光检测方法，包括以下步骤：S1：将石墨烯量子点免疫荧光探针与菌液等体积混匀后进行孵育得到探针-菌液混合液体；S2：用微量移液器移取孵育后的探针-菌液混合液体，滴在载玻片上，在无菌的环境下风干后盖上盖玻片形成带有样品的载玻片；S3：将载玻片置于带有油镜的荧光显微镜进行观察，通过紫外光或蓝光绿光激发检测载玻片上的样品，并通过样品是否有荧光发出、荧光强度的高低及菌的形貌能否清晰呈现指标来确定样品中是否含有大肠杆菌O157:H7以及大肠杆菌O157:H7含量。进一步，所述S1中探针与菌液的混合孵育温度为37℃，孵育时间为60-120min。进一步，所述S2中移取的孵育后的探针-菌液混合液体的体积为10μL，无菌环境下风干的时间为10-15min。进一步，所述S3中所用的荧光显微镜是带有油镜的荧光显微镜或放大倍数大于1000倍的荧光显微镜。由于采用了上述技术方案，本专利技术具有如下的优点：本专利技术提供的E.coli.O157:H7的石墨烯量子点(GQDs)免疫荧光检测方法。首先配制EDC、NHS的PBS溶液，并将EDC溶液缓慢滴加入石墨烯量子点的溶液中，于37℃反应10-15min后，再缓慢滴入NHS溶液，再滴入一定量PBS定容，形成溶液A；将10-30μL的大肠杆菌O157:H7抗体溶于PBS中，形成溶液B；将200-400μL的溶液A与200-400μL的溶液B混合形成混合溶液，并于37℃摇晃的条件下反应40-90min，即形成石墨烯量子点免疫荧光探针溶液，记为溶液C。将100-200μL的探针溶液与100-200μL的菌液混匀，并于37℃摇晃的条件下孵育1-2h后，抽取10μL孵育后的探针-细菌溶液，于带有油镜的荧光显微镜观察。通过评价探针-细菌样本是否发荧光、荧光强度情况、发荧光菌种数量多少等信息判断菌液中是否含有大肠杆菌O157:H7以及大肠杆菌O157:H7含量的多少。本专利技术采用免疫荧光探针来检测肠出血性大肠杆菌O157:H7，可快速、准确的评价样本中含有肠出血性大肠杆菌O157:H7的情况，该检测方法具有操作简单，耗时少，所需试剂少且易得，重现性好，灵敏度高，特异性好，对检测设备要求低等优点。本专利技术提供了一种E.coli.O157:H7快速、简便、经济、准确、灵敏的检测方法，可以满足日常、临床对准确、快速检测E.coli.O157:H7的迫切要求，应用前景好。本专利技术的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本专利技术的实践中得到教导。本专利技术的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。附图说明本专利技术的附图说明如下。图1为本专利技术实施例提供的E.coli.O157:H7的石墨烯量子点免疫荧光检测方法流程图。图2a氨基化石墨烯量子点检测E.coli.O157:H7在紫外光激发下的荧光照片。图2b氨基化石墨烯量子点检测E.coli.O157:H7在蓝光激发下的荧光照片。图2c羧基化石墨烯量子点检测E.coli.O157:H7在紫外光激发下的荧光照片。图2d羧基化石墨烯量子点检测E.coli.O157:H7在蓝光激发下的荧光照片。图3为本专利技术实施例提供的Amino-GQDs与大肠杆菌抗体偶联示意图。图4为本专利技术实施例提供的GQDs–大肠杆菌抗体荧光探针对大肠杆菌检测的示意图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
大肠杆菌石墨烯量子点免疫荧光探针溶液制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：按比例称取BSA、EDC和NHS，分别溶于2‑6mL的0.01M，pH7.4的PBS缓冲液中，得到EDC的PBS溶液和NHS溶液的PBS溶液；S2：将EDC的PBS溶液滴加入石墨烯量子点的溶液中充分反应形成GQDs溶液；S3：将NHS的PBS溶液滴入GQDs溶液中，再加入PBS缓冲液中形成溶液A；S4：将大肠杆菌抗体溶于PBS缓冲液中，形成溶液B；S5：将溶液A与溶液B混合，并滴入适量的BSA的PBS溶液，反应形成量子点免疫荧光探针溶液C。

【技术特征摘要】
1.大肠杆菌石墨烯量子点免疫荧光探针溶液制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：按比例称取BSA、EDC和NHS，分别溶于2-6mL的0.01M，pH7.4的PBS缓冲液中，得到EDC的PBS溶液和NHS溶液的PBS溶液；S2：将EDC的PBS溶液滴加入石墨烯量子点的溶液中充分反应形成GQDs溶液；S3：将NHS的PBS溶液滴入GQDs溶液中，再加入PBS缓冲液中形成溶液A；S4：将大肠杆菌抗体溶于PBS缓冲液中，形成溶液B；S5：将溶液A与溶液B混合，并滴入适量的BSA的PBS溶液，反应形成量子点免疫荧光探针溶液C。2.如权利要求1所述的大肠杆菌石墨烯量子点免疫荧光探针溶液制备方法，其特征在于：所述步骤S2中将EDC溶液缓慢滴加入石墨烯量子点的溶液后，反应的温度是36-37.5℃，反应时间为10-15min。3.如权利要求1所述的大肠杆菌石墨烯量子点免疫荧光探针溶液制备方法，其特征在于：所述步骤S4中溶于PBS溶液的大肠杆菌O157:H7抗体的用量是10-30μL。4.如权利要求1所述的大肠杆菌石墨烯量子点免疫荧光探针溶液制备方法，其特征在于：所述步骤S5中溶液A和溶液B的用量均为200-400μL，摇晃反应的温度条件为36-37.5℃，反应的时间为40-90min。5.如权利要求1所述的大肠杆菌石墨烯量子点免疫荧光探针溶液制备方法，其特征在于：所述NHS溶液为N-羟基琥珀酰亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐中的一种。6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯路桥，杨晓占，方建东，
申请(专利权)人：冯路桥，
类型：发明
国别省市：重庆;50