多发性骨髓瘤耐药性基因突变检测试剂盒及应用方法技术

本发明专利技术提供了一种多发性骨髓瘤耐药性基因突变检测试剂盒及应用方法，旨在通过对与多发性骨髓瘤抗药性相关的CRBN、DDB1、CUL4B、IRF4、NR3C1、XBP1、PSMG2和PSMB5八个基因进行突变检测，获得多发性骨髓瘤靶点治疗用药的新的基因学支撑；本发明专利技术提供了包含所述八个基因的特异性引物的试剂的试剂盒，并提供了应用所述试剂盒的检测方法，可针对各个基因的高突变位点进行全面、准确的检测，检测结果对于临床具有很强的指导意义，可用于多发性骨髓瘤的快速精准治疗，避免无谓的治疗用药，在医学检测领域中可发挥非常重要的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学及分子生物学
，特别涉及一种用于多发性骨髓瘤耐药性相关基因突变检测的试剂盒，本专利技术还涉及所述试剂盒在上述基因突变检测中的应用方法。
技术介绍
多发性骨髓瘤(MultipleMyeloma,MM)是一种浆细胞癌症，表现为骨髓中异常浆细胞的侵润，它是一种最普遍的血液癌症，大概占所有癌症总数的1％。位居常见血液系统恶性肿瘤的第二位。尽管新的治疗方法取得了巨大成果，使骨髓瘤患者预后有了明显改善，患者平均生存时间由过去的3～4年延长至5～7年，但骨髓瘤目前仍旧为无法治愈的肿瘤。MM发病机制是由B淋巴细胞分化为浆细胞过程中遗传基因发生突变，约半数病例发生染色体易位，即癌基因易位到14号染色体的免疫球蛋白重链基因(IgH基因易位)，导致癌基因过表达和细胞增殖失控；其它病理特征是细胞具有部分奇数三倍体，即染色体3、5、7、9、11、15、19和21，这些众多三体的表现称为超二倍性。随着研究的不断进展，发现骨髓瘤中也存在一些基因突变，如RAS基因突变。因为骨髓瘤细胞增长和存活要依赖骨髓中其他的细胞，比如成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞、基质细胞和树突状细胞，故以骨髓微环境为靶标的治疗方法有所进展，但由于骨髓瘤细胞异质性强，患者容易出现复发耐药，如何为患者选择合适的治疗方案仍然是一个难题。早些年MM的常规和标准治疗方法是化疗和自体同源干细胞移植，然而当前随着新的药物靶点的发现，更多的新药被开发用于治疗骨髓瘤，包括Bortezomib(硼替佐米，一种蛋白酶体抑制剂)、Thalidomide(沙利度胺)和相应的ImiDs(ImmunomodulatoryDrugs，免疫调节剂)药物如Lenalidomide(来那度胺)等。近期研究揭示了IMiDs用来治疗MM的机制，IMiDs被发现能和CRL4A泛素连接酶的一个接头蛋白CRBN(Cereblon)结合，从而激活CRL4A-CRBN泛素连接酶的活性来靶向并泛素化降解B细胞特异性的两个转录因子IKZF1和IKZF3，而IKZF1和IKZF3对骨髓瘤细胞的存活至关重要；多项体内及体外的研究发现，CRBN基因低表达或缺失可能与IMiDs治疗MM的耐药性相关，且其基因表达水平可能与MM患者的预后相关，最近研究进一步发现，IKZF1、IKZF3、IRF4、C/EBPβ等蛋白以及Wnt/catenin信号通路等可能也与IMiDs的耐药机制相关。在早期，抗癌药Bortezomib是唯一一种已被证明能够延缓新诊和复发性MM总生存期(Overallsurvival,OS)的药物，在MM的临床治疗中发挥了重要作用。临床研究表面，Bortezomib和IMiDs联用可以有效地提高多发性骨髓瘤患者的存活率，并用来治疗经单一药物治疗后复发的患者；研究表明，CRBN是IMiDs治疗MM的直接结合靶点，在抗肿瘤细胞增殖、诱导骨髓瘤细胞凋亡、抗新生血管形成、增强T细胞和NK细胞免疫活性、抑制细胞间黏附分子表达中发挥重要作用，当CRBN不和CRL4A泛素连接酶结合时，它本身是不稳定的，能被另一个泛素连接酶SCFFbxo7泛素化降解，所以在骨髓瘤细胞中，Bortezomib能稳定CRBN的水平，使更多的CRBN与CRL4A泛素连接酶结合，促进IMiDs所诱发的IKZF1/3的降解，从而产生对骨髓瘤细胞的协同抑制作用。虽然Bortezomib和IMiDs联用能取得更好的临床效果，但是Bortezomib作为一种蛋白酶体抑制剂，它会抑制IMiDs所诱发的IKZF1/3降解，理论上可产生抑制IMiDs的作用，因此Bortezomib的使用产生了一个矛盾。2010年科学家发现Thalidomide与CRBN直接结合，CRBN则与DDB1(DamagedDNAbindingprotein1)、CUL4A(Cullin4A)、ROC1形成CRL4泛素连接酶复合物。突变CRBN的两个关键氨基酸残基(Y384A/W386A双突变，记作CRBNYW/AA)可以避免Thalidomide的结合但保留自泛素化活性，Thalidomide无法抑制CRBNYW/AA的自泛素化。斑马鱼胚胎注射CRBN反义核酸后，鱼鳍和耳泡发育出现缺陷，与Thalidomide处理的结果相似，同时注射CRBNmRNA可抵消反义核酸的作用。对于野生型CRBN胚胎，Thalidomide处理后耳泡大小下降，而对于CRBNYW/AA型CRBN胚胎，Thalidomide没有影响，Thalidomide诱导的胸鳍畸形可以通过过度表达CRBNYW/AA型CRBN逆转。2014上半年Science探索了CRBN的下游信号，发现Lenalidomide可诱导IKZF1和IKZF3的泛素化降解，IKZF1和IKZF3是MM细胞的重要转录因子，同时可抑制T细胞产生IL-2(T细胞生长因子)，这也解释了这类药物可作为ImiDs的机理。Thalidomide、Lenalidomide和下一代的免疫调节剂Pomalidomide(泊马度胺)的化学结构极其相似，与CRBN结合的Ki值分别为249.2nM、177.8nM和156.6nM。但是度胺类药物的设计不应当只考虑对CRBN的亲和力，因为这类药物既是激活剂又是拮抗剂，最新的Nature揭秘了这种非常神奇的结合模式。度胺类药物进入CRBN结合口袋后，产生了一个新的界面，可以阻止部分底物如MEIS2的结合，却又能促进某些底物如IKZF1、IKZF3的结合。这也解释了为什么Lenalidomide和Pomalidomide的C4上仅多出一个氨基，但诱导IKZF1、IKZF3降解的能力却比Thalidomide高出很多的现象。综上所述，随着基因学研究的不断深入以及治疗药物，如IMIDs和万珂类的不断被开发，有针对性的选择新的药物进行MM治疗就更加迫切，如何实现MM样本抗药性的快速检测从而为临床针对性药物治疗提供引导，成为当前亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术中MM样本的抗药性检测的不足，提供一种多发性骨髓瘤耐药性基因突变检测试剂盒及应用方法。所述试剂盒包含本专利技术筛选的与MM抗药性相关的八个重要基因的特异性引物试剂，结合聚合酶链式反应(PCR)和基因测序技术，可实现灵敏、快速且针对性强的MM耐药性基因突变的检测，其检测结果可为MM的针对性药物治疗提供有效的依据。为了实现上述技术目的，本专利技术实施例提供的技术方案为：一种多发性骨髓瘤耐药性基因突变检测试剂盒，所述试剂盒包括与基因CRBN、DDB1、CUL4B、IRF4、NR3C1、XBP1、PSMG2和PSMB5的热点突变所属外显子区段分别对应的多对特异性引物，每对所述特异性引物包括一正向引物和一反向引物。优选的，对应所述特异性引物的外显子分别为：基因CRBN的第3号、第6号和第11号外显子，基因DDB1的第2号、第8号、第9号和第24号外显子，基因CUL4B的第10号外显子，基因IRF4的第3号外显子，基因NR3C1的第2号外显子，基因XBP1的第2号外显子，基因PSMG2的第5号外显子，和基因PSMB5的第1号外显子。进一步优选的，与所述外显子分别对应的特异性引物在序列表中分别为：基因CRBN外显子：第3号正向本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多发性骨髓瘤耐药性基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括与基因CRBN、DDB1、CUL4B、IRF4、NR3C1、XBP1、PSMG2和PSMB5的热点突变所属外显子区段分别对应的多对特异性引物，每对所述特异性引物包括一正向引物和一反向引物。

【技术特征摘要】
1.一种多发性骨髓瘤耐药性基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括与基因CRBN、DDB1、CUL4B、IRF4、NR3C1、XBP1、PSMG2和PSMB5的热点突变所属外显子区段分别对应的多对特异性引物，每对所述特异性引物包括一正向引物和一反向引物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，对应所述特异性引物的外显子分别为：基因CRBN的第3号、第6号和第11号外显子，基因DDB1的第2号、第8号、第9号和第24号外显子，基因CUL4B的第10号外显子，基因IRF4的第3号外显子，基因NR3C1的第2号外显子，基因XBP1的第2号外显子，基因PSMG2的第5号外显子，和基因PSMB5的第1号外显子。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，与所述外显子分别对应的特异性引物在序列表中分别为：基因CRBN外显子：第3号正向引物：SEQIDNO.1反向引物：SEQIDNO.2；第6号正向引物：SEQIDNO.3反向引物：SEQIDNO.4；第11号正向引物：SEQIDNO.5反向引物：SEQIDNO.6；基因DDB1外显子：基因CUL4B外显子：第10号正向引物：SEQIDNO.15反向引物：SEQIDNO.16；基因IRF4外显子：第3号正向引物：SEQIDNO.17反向引物：SEQIDNO.18；基因NR3C1外显子：第2号正向引物：SEQIDNO.19反向引物：SEQIDNO.20；基因XBP1外显子：第2号正向引物：SEQIDNO.21反向引物：SEQIDNO.22；基因PSMG2外显子：第5号正...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅廷娇，陈欣，张娟，李悠南，程宇，王绪华，梁超，陈忠，黄士昂，
申请(专利权)人：北京海思特临床检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11