青蒿素 B抑制A549细胞迁移侵袭的作用制造技术

本发明专利技术涉青蒿素B，其分子量为248 g/mol。本论文公开了青蒿素B在制备抑制肿瘤细胞侵袭转移药物中的应用。本发明专利技术的重要之处是发现青蒿素B具有抑制肺癌A549细胞迁移侵袭的作用，具体包括青蒿素B对A549细胞的克隆增殖具有明显的抑制作用；青蒿素B浓度依赖性地抑制A549细胞的粘附能力；划痕实验、Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验的结果表明：青蒿素B能有效减弱A549细胞的迁移和侵袭能力，并具有浓度依赖性；微丝荧光染色实验结果显示，青蒿素B浓度依赖性地抑制A549细胞伪足的形成。此外，青蒿素B对侵袭转移相关蛋白有明显影响，实验结果表明青蒿素B通过直接抑制STAT3的磷酸化和beta‑catenin进而下调MMP2和MMP9的表达。因此，青蒿素B具有制备抑制人肺癌细胞侵袭转移药物的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药
，具体涉及青蒿素B在抑制A549细胞迁移侵袭中的应用。
技术介绍
肺癌严重危害了人类的健康，是预后最差的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC）在肺癌中所占比例超过80%。70%的肺癌患者的死亡是由癌症转移所导致的。我国肺癌死亡率为27.93/10万（男性39.79/10万，女性16.62/10万），呈现逐年上升趋势，肺癌是影响我国居民健康的主要恶性肿瘤之一。肺癌转移是肺癌的恶性标志和特征，是肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因，同时也是患者肿瘤复发、病情恶化而最终死亡的病理基础，其占所有发病率的90%。手术、放射治疗、化学治疗及各种辅助治疗能有效遏制非小细胞肺癌的发展，然而由于肺癌的转移及其对已知化疗药物产生的耐药性，最终导致多数肺癌患者治疗的失败。目前，对于非小细胞肺癌转移即已有远处转移的治疗手段主要为采用化疗药物抑制转移肿瘤的增殖及诱导其凋亡，而应用于临床的针对原发肿瘤的化疗药物对转移性肿瘤并没有显著性疗效。现今治疗非小细胞肺癌晚期患者的药物治疗方法主要为一线方案治疗法（铂类与第三代化疗药物如紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨和多西紫杉醇等的联合用药）和二线药物治疗法（包括多西他赛、厄洛替尼和培美曲塞）。然而，晚期非小细胞肺癌患者的5年生存率低于5%，且因化疗药物存在骨髓抑制、心脏毒性等严重的毒副作用，局限了它们在临床上的使用。因此，开发高效低毒的新型抗肺癌转移药物是至关重要的。青蒿素是以屠呦呦为首的中国中医科学院于1971年从中药黄花蒿中成功找到抗疟的有效成分，是我国自主研制的抗疟特效药。目前青蒿素类化合物的研究发现青蒿素及其衍生物除了抗疟作用外，亦被证明具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗纤维化、调节免疫功能等药理作用。在20世纪90年代，青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用及机制的研究越来越多。青蒿素及其衍生物对多种肿瘤细胞有杀伤作用也已被证明。国内外学者对青蒿素类化合物抗肿瘤作用进行了不断深入的研究。Woedenbag等报道用MTT法检测发现，青蒿素有关的内过氧化物对艾氏腹水癌细胞有抑制作用。Huang等对双氢青蒿素的研究结果表明，双氢青蒿素通过增加活性氧、抑制缺氧诱导的相关因子的激活，对大鼠C6细胞具有选择性细胞毒作用。此外，研究发现二氢青蒿素能阻断beta-catenin通路而抑制骨癌的转移。青蒿素B作为青蒿素生物合成过程中的重要中间体，与其它青蒿素类化合物相比，具有毒性较低的特点并显示出良好的抗肿瘤活性。经查阅文献未见青蒿素B的抗肿瘤迁移侵袭作用的研究报道，其具有作为抗肿瘤药物潜在的开发价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种青蒿素类药物治疗肿瘤疾病药物中的应用，青蒿素B在制备抗肿瘤转移药物中的应用。本专利技术是通过如下的技术方案来实现的：采用划痕实验、粘附实验、克隆形成实验、Transwell迁移/侵袭实验、微丝荧光染色等技术研究青蒿素B对肿瘤细胞的迁移侵袭的抑制作用；采用Westernblotting法、q-PCR法、免疫荧光实验研究青蒿素B对肿瘤细胞迁移侵袭相关信号通路的影响，探究其作用机制。本专利技术相对于现有技术有益效果在于：（1）青蒿素B对A549细胞粘附和克隆形成具有明显的抑制作用，同时抑制A549细胞丝状伪足的形成而影响细胞的运动能力进而抑制细胞的迁移侵袭能力。（2）青蒿素B抑制STAT3的活化和beta-catenin的表达，下调MMP-2和MMP-9的蛋白表达来抑制A549细胞的迁移侵袭。（3）青蒿素B可能通过直接靶向抑制STAT3的活化，抑制其磷酸化入核，从而调控A549细胞的迁移侵袭。本专利技术为研制新的抗肿瘤转移药物提供了科学依据，对开发利用传统中药具有重要意义。附图说明图1为实例1中检测青蒿素B对A549细胞克隆形成的抑制作用。图2为实例2中检测青蒿素B对A549细胞粘附的抑制作用。图3-5为实例3中检测青蒿素B对A549细胞迁移的抑制作用。图6为实例4中检测青蒿素B对A549细胞侵袭的抑制作用。图7-11为实例5中Westernblot检测青蒿素B对A549细胞迁移侵袭相关蛋白的影响。图12为实例6中q-PCR检测青蒿素B对A549细胞MMP-2、MMP-9、beta-catenin的mRNA水平的影响。图13为实例7中免疫荧光检测青蒿素B对A549细胞中STAT3转位入核的抑制作用。具体实施方式：下面结合技术方案和图表详细说明本专利技术的具体实施例。实施例1:青蒿素B对A549细胞克隆形成的影响取对数生长期的单层培养细胞，制备100cells/mL的细胞悬液。将细胞接种于6孔板，2mL/孔，37℃、5%CO2培养箱培养过夜。加药培养：弃去孔内上清液，加入青蒿素B药液（0.625、1.25、2.5和5μM）2mL/孔，每个浓度设3个复孔。实验设加药组和阴性对照组，37℃、5%CO2的条件下继续培养14天，观察克隆情况，期间换一次液。培养14天后，弃去培养板中旧培养液，用PBS洗两次，用甲醇固定细胞30min。结晶紫染色30min，浸自来水中冲洗多余的染色液。将6孔板置于带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆。结果显示：随着青蒿素B的浓度增加，A549细胞的克隆数目逐渐减少，克隆形成能力减弱；5μM青蒿素B对细胞克隆形成能力的抑制率达到60%左右，相比于阴性对照组具有显著性差异（P<0.01），可见青蒿素B明显抑制A549细胞的克隆形成，对A549细胞的增殖作用具有显著的抑制，且具有浓度依赖性，见图1。实施例2:青蒿素B对A549细胞粘附的影响取对数生长期的单层培养细胞，配制105cells/mL的细胞悬液。用细胞悬液配制青蒿素B溶液，终浓度分别为40，20，10，5μM。将含不同浓度的青蒿素B细胞悬液接种于6孔板中，2ml/孔，每个浓度3个复孔。实验设加药组和阴性对照组。37℃、5%CO2的培养箱培养2.5h后，用PBS轻轻洗两次去除未贴壁的细胞。用甲醇固定1h，结晶紫染色1h，浸自来水中冲洗多余的染色液，拍照并计数。结果显示：青蒿素B浓度为20μM和40μM时，粘附的细胞数目明显少于对照组的细胞数目，且青蒿素B（40μM）对于细胞粘附能力的抑制率达70%，相比于阴性对照组具有显著性差异（P<0.01），而青蒿素B（5μM和10μM）对于细胞粘附的影响较对照组无显著性差异。该结果表明青蒿素B能影响A549细胞的粘附，见图2。实施例3:青蒿素B对A549细胞迁移的影响①划痕愈合实验：用直尺和Marker笔在6孔板底部画好线，将孔分布成3部分。制备5×105cells/mL的细胞悬液，接种于6孔板，2mL/孔，过夜铺满。划痕：用10μL的枪头造划痕，该划痕经过底部的三条线，用PBS洗细胞2次，去除划下的细胞，并拍照。加药培养：制备4个不同浓度青蒿素B溶液（即40、20、10、5μM），2mL/孔，每个浓度3个复孔，实验设加药组和阴性对照组。37℃、5%CO2的培养箱培养24h后观察并拍照。②Transwell迁移实验：制备8×104cells/200μl的细胞悬液，用细胞悬液配制不同浓度的青蒿素B溶液（0、5、10、20、40μM）加入到小室内层。共培养24h。外层加入80本文档来自技高网...

【技术保护点】
青蒿素B体外抑制肺癌A549细胞迁移侵袭的作用。

【技术特征摘要】
1.青蒿素B体外抑制肺癌A549细胞迁移侵袭的作用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的体外实验所用的细胞株为非小细胞肺癌（A549）。3.根据权利要求1所述的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：于荣敏，刘婷，宋丽艳，
申请(专利权)人：于荣敏，
类型：发明
国别省市：广东;44