抗口蹄疫O型病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原、抗体检测中的应用制造技术

本发明专利技术抗口蹄疫O型病毒的单克隆抗体及抗体组合以及其在该病毒抗原、抗体检测中的应用，提出了口蹄疫O型病毒的非特异性单克隆抗体4H9anti及抗体组合，包括口蹄疫O型病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti及非特异性单克隆抗体2H10anti和非特异性单克隆抗体4H9anti。本发明专利技术可以实现对口蹄疫O型病毒抗原和抗体的检测，且能快速检出多种O型病毒毒株，用于检测口蹄疫O型病毒具有较好的广谱性，并具有高特异性、高灵敏度、快速检测的特点，可用于口蹄疫O型病毒疫苗生产、相关产品质检以及疫苗免疫效果的评价。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及口蹄疫O型病毒的单克隆抗体、分泌抗体的杂交瘤细胞株以及该抗体与其它抗体的组合与应用，该应用体现在通过对口蹄疫O型病毒的抗原和抗体检测，实现疫苗生产过程中对原料、中间产品和成品的监控，以及口蹄疫O型疫苗免疫后血清抗体水平的监控。
技术介绍
口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的传染病。FMDV目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。近十几年以来，全世界口蹄疫的流行态势发生了一些新的变化。一方面未消灭口蹄疫的国家和地区，口蹄疫继续流行，而另一方面已控制和消灭口蹄疫的国家和地区，也出现口蹄疫的发生和流行。从FAO/OIE口蹄疫参考实验室报告的资料来看，在1990～2002年之间，口蹄疫在世界范围内的流行还是非常严重的，7个型的口蹄疫均有流行，其中以O、A、和Asia1型的流行较为严重。FMDV属于微核糖核酸病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(aphthavirus)的成员。感染FMDV的细胞培养液，电镜下观察，有四种粒子。最大粒子为完整病毒，直径23±2nm，沉降系数为146S，具有感染性，呈圆形或六角形，正二十面体对称，分子量6.9×106Da，无囊膜，在氯化艳中的浮密度为1.43g/ml。病毒由中央的核糖核酸核芯和周围的蛋白壳体所组成，成熟病毒粒子约含30％的RNA，其余70％为蛋白质。第二种为不含有RNA的空衣壳，直径21nm，沉降系数为75S，没有感染性，有型特异性和免疫原性；第三种为衣壳蛋白亚单位，其直径为7nm，沉降系数为12S～14S，无RNA，无感染性，有抗原性；第四种为病毒感染相关抗原(Virusinfection-associatedantigen，VIA抗原)，沉降系数为4.5S，为病毒的非结构蛋白(病毒RNA聚合酶)，能诱发动物产生群特异抗体，无型特异性，在琼脂扩散试验中对各型口蹄疫病毒的抗体都呈现反应，可以应用VIA抗原检测各型口蹄疫病毒感染动物的血清抗体。目前，口蹄疫病毒在全世界主要有7个血清型，以及65个以上亚型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病，因此常常用多价疫苗来降低患口蹄疫的风险。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，我国流行的口蹄疫主要为O、A、C三型及ZB型(云南保山型)。口蹄疫O型包含多种毒株：O/GX/09-7、O/Mya98/XJ/2010、O/Mya98/BY/2010、O/JMS/2000、OZK/93等。目前，口蹄疫灭活疫苗是预防该病发生的主要有效手段，主要通过将口蹄疫病毒体外培养后、灭活，然后与乳化剂混合制成免疫疫苗。为保证免疫效果，很多疫苗生产商将口蹄疫多种毒株混合在一起制成多价或多组分疫苗，比如金宇保灵生物药品有限公司生产的口蹄疫三价疫苗中包含口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)、口蹄疫A型(Re-A/WH/09)和口蹄疫亚洲1型(JSL/06)三种毒株。FMDV的免疫是依赖T细胞的B细胞应答，疫苗接种主要诱导中和抗体的产生。疫苗接种是特异性预防FMDV的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功预防、控制乃至最终消灭FMDV的先决条件。FMDV弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在预防和控制FMDV的过程中发挥着重要作用。准确、特异、快速地检测口蹄疫病毒抗原的水平在疫苗生产监控等方面具有重要意义。实际工作中，疫苗生产商常采用蔗糖密度梯度离心法对口蹄疫抗原进行定量检测，但是该法操作复杂、时间长、投入大，不便于推广。除此之外，也有人采用PCR分子检测方法检测口蹄疫病毒，PCR是一个高灵敏的方法，但特异性存在不足，且不适合生产定量。单克隆抗体因其针对的抗原位点单一，特异性较好，并且生产的重复性优于多克隆抗体，目前在很多检测中被采用。国内偶见有制备口蹄疫单克隆抗体的研究，但仅限于在对单一特定病毒(如专利文献CN105296434A针对O/Mya98/BY/2010病毒，专利文献CN105348386A针对O/GX/09-7病毒)检测中应用，尚不足以应用到对多种口蹄疫O型病毒的检测，获得针对多种口蹄疫O型病毒特异性以及应用性好的单克隆抗体或组合及能够将其应用于口蹄疫O型病毒的检测仍是研究人员的努力目标。猪、牛注射口蹄疫疫苗后，通常需要检测其血清中抗体效价水平来判断是否具有足够的保护性。目前市场上可见的检测抗体水平的产品有中国农业科学院兰州兽医研究所生产的液相阻断ELISA试剂盒、韩国金诺竞争法ELISA试剂盒、美国IDEXX公司生产的ELISA试剂盒等，这些试剂盒都采用ELISA法检测抗体水平，常常需要2个小时以上的时间。其中，兰州兽医研究所生产的ELISA试剂盒中采用的是兔、豚鼠多克隆抗体。众所周知，多克隆抗体针对多个抗原位点，并且多克隆抗体的批次差异大。而单克隆抗体针对单一的抗原位点，且在制备过程中重复性更好。胶体金免疫纸层析是一种基于抗原抗体的快速检测方法，可以在10-20分钟内完成检测，不需要大型的仪器设备，非常适合于现场检测。从操作易用性方面，优于ELISA产品。另外，它可通过目测进行定性检测，也可配套小型的仪器实现定量检测或半定量检测，如北京快锐读科技有限公司生产的KRD-100免疫层析分析记录仪等。如能以单克隆抗体胶体金法实现口蹄疫疫苗抗原检测以及疫苗免疫后抗体水平的快速测量，在现场、野外或小规模的养殖场会有很大的用途和意义。
技术实现思路
为实现对口蹄疫O型病毒抗原和抗体的检测，本专利技术提出以下几方面内容：本专利技术的一个目的是提供口蹄疫O型病毒(O/Mya98/BY/2010)的非特异性单克隆抗体4H9anti。所述非特异性单克隆抗体4H9anti的重链可变区具有序列表中的SEQIDNo：13的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：13的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒非特异结合的多肽；轻链可变区具有序列表中的SEQIDNo：14的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：14的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒非特异结合的多肽。序列表中的SEQIDNo：13由122个氨基酸残基组成，序列表中的SEQIDNo：14由104个氨基酸残基组成。编码单克隆抗体4H9anti的基因(4H9anti)，其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：15的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：13的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：15限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：16的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：14的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：16限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在本文档来自技高网...

【技术保护点】
口蹄疫O型病毒的非特异性单克隆抗体4H9anti，其特征在于：其重链可变区具有序列表中的SEQ ID No：13的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：13的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒非特异结合的多肽，其轻链可变区具有序列表中的SEQ ID No：14的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No：14的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/XJ/2010)病毒非特异结合的多肽。

【技术特征摘要】
1.口蹄疫O型病毒的非特异性单克隆抗体4H9anti，其特征在于：其重链可变区具有序列表中的SEQIDNo：13的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：13的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/BY/2010)病毒非特异结合的多肽，其轻链可变区具有序列表中的SEQIDNo：14的氨基酸残基序列或将序列表中SEQIDNo：14的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可与口蹄疫O型(O/Mya98/XJ/2010)病毒非特异结合的多肽。2.编码权利要求1所述单克隆抗体4H9anti的基因(4H9anti)，其特征在于：其重链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：15的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：13的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：15限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，其轻链可变区编码基因具有序列表中SEQIDNo：16的DNA序列或编码序列表中SEQIDNo：14的DNA序列或在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNo：16限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQIDNo：15由366个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：13的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQIDNo：16由312个碱基组成，编码具有序列表中SEQIDNo：14的氨基酸残基序列的蛋白质。3.分泌权利要求1所述抗口蹄疫O型病毒的非特异性单克隆抗体4H9anti的杂交瘤细胞株4H9，其保藏编号为CGMCCNo.12673。4.单克隆抗体4H9anti在制备检测口蹄疫O型病毒抗体的金标纸层析试纸中的应用。5.一种口蹄疫O型病毒抗体检测金标纸层析试纸，由玻璃纤维膜样品垫、结合物释放垫、吸水垫、硝酸纤维素膜(NC膜)组成，硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)；其中：用权利要求1或2或4中提及的单克隆抗体4H9anti包被检测线，结合物释放垫上包被有用胶体金标记的口蹄疫O型病毒抗原；所述口蹄疫O型抗原为O/GX/09-7、O/Mya98/XJ/2010、O/Mya98/BY/2010、O/JMS/2000、OZK/93中的一种或几种组合，优选O/JMS/2000毒株或者O/GX/09-7与O/Mya98/BY/2010的等质量混合物。6.口蹄疫O型病毒抗体检测金标纸层析试纸盒，是将权利要求5所述口蹄疫O型病毒抗体检测金标纸层析试纸装入塑料卡中，制成测试卡，并组装成试纸盒，该试纸盒对应于样品垫的部位设有点样口，对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。7.权利要求5所述的试纸或权利要求6所述的试纸盒在检测口蹄疫O型病毒疫苗免疫后抗体中的应用，其特征在于，采用竞争法原理检测标本的口蹄疫O型病毒抗体，包括：将待检样品滴在样品位置，观测检测线(T线)和质控线(C线)是否出现色带，通过与临界值质控血清颜色深浅比较来判断阴、阳性，或进一步通过仪器检测T线颜色深浅来定量测量口蹄疫O型抗体效价水平。8.一种用于检测口蹄疫O型病毒抗原的单克隆抗体组合，包括口蹄疫O型病毒的特异性单克隆抗体6D6anti和1F2anti及非特异性单克隆抗体2H10anti和权利要求1所述的非特异性单克隆抗体4H9anti；所述特异性单克隆抗体6D6anti为与口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒特异结合的多肽，其重链可变区具有序列表中SEQIDNo：1的氨基酸残基序列，轻链可变区具有序列表中SEQIDNo：2的氨基酸残基序列；所述非特异性单克隆抗体2H10anti为与口蹄疫O型(O/GX/09-7)病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑金来，吴园园，
申请(专利权)人：北京三联博悦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11