植物源高效转录激活功能域SAC3及应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，提供一种植物源高效转录激活功能域SAC3及应用，其氨基酸序列为DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQFAVFDDTADSAWDVVNLEAFIDGDYSTSWELETIC。本发明专利技术从杉木的cDNA文库中分离得到一段高效转录激活序列SAC3，CPRG结果显示其转录激活功能在酵母中为VP16的19倍左右；以Gal4‑UAS为基础的双荧光素酶系统结果显示：在拟南芥中SAC3的转录激活活性为VP16的两倍以上、EDLL的50倍。SAC3可以应用于植物的基因工程技术中，用以精确激活植物体内特定基因的表达，改善植物与该特定基因相关的重要性状，大幅提高作物的经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种植物源高效转录激活功能域SAC3及应用。
技术介绍
全球人口的日益膨胀和生存环境的改变，给农作物的经营和发展提出了极大的挑战。兴起于上世纪80年代的基因工程技术，是大幅改善农作物的产量及提高其对环境改变的适应性的强有力手段。基因技术在植物中有大规模的应用，常将外源基因直接随机整合入目标植物基因组中，并以此改善植物一些重要性状，如抗除草剂和抗虫性。然而这种方法可能会产生一些副作用，而且无法达到精确控制特定基因表达的效果。拟转录激活因子效应器，Transcription activator-like effectors (TALEs)，是实现精确控制特定基因表达最有效和应用最广泛的技术；以及近年来CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat - CRISPR-associated 9）系统的开发和应用，生物体的研究和改造带来巨大潜力，这类人工合成的转录调节因子为精确控制植物內源基因的表达提供了可靠的工具。然而由于其转录激活活性的发挥完全取决于转录激活功能域。迄今为止应用在基因工程中的效果显著的转录激活功能域基本来源于动物病毒（VP16），在植物中缺乏完全匹配的工作环境，使其功能发挥受到限制。已知的植物中的转录激活因子主要是对环境因素响应的蛋白，其中EDLL motif为已报道的最强植物源转录激活因子，该功能域的发现和运用让人们有理由相信植物中存在强大的转录激活功能域，但其转录激活功能与VP16相比依然很低，以酵母为筛选载体，本专利技术从杉木的cDNA文库中分离得到一段高效转录激活序列SAC3(Strong Activation domain from China fir-3)，CPRG结果显示其转录激活功能在酵母中为VP16的19倍左右；以Gal4-UAS为基础的双荧光素酶（LUC和REN）系统结果显示：在拟南芥中SAC3的转录激活活性为VP16的两倍以上、EDLL的50倍。SAC3可以应用于植物的基因工程技术中，用以精确激活植物体内特定基因的表达，改善植物与该特定基因相关的重要性状，大幅提高作物的经济价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种植物源高效转录激活功能域SAC3及应用，可以应用于植物的基因工程技术中，用以精确激活植物体内特定基因的表达，改善植物与该特定基因相关的重要性状，大幅提高作物的经济价值。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：植物源高效转录激活功能域SAC3，所述的SAC3的氨基酸序列为DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQFAVFDDTADSAWDVVNLEAFIDGDYSTSWELETIC。所述的植物源高效转录激活功能域SAC3在改善植物基因表达中的应用。本专利技术的优点在于：本专利技术从杉木的cDNA文库中分离得到一段高效转录激活序列SAC3(Strong Activation domain from China fir-3)，CPRG结果显示其转录激活功能在酵母中为VP16的19倍左右；以Gal4-UAS为基础的双荧光素酶（LUC和REN）系统结果显示：在拟南芥中SAC3的转录激活活性为VP16的两倍以上、EDLL的50倍。SAC3可以应用于植物的基因工程技术中，用以精确激活植物体内特定基因的表达，改善植物与该特定基因相关的重要性状，大幅提高作物的经济价值。附图说明图1 TUP1转录激活因子筛选系统简图。图2 杉木文库在酵母TUP1系统中筛选结果的自激活能力。图3 SAC3转录激活功能域的确定。图4植物中SAC3的转录激活能力。具体实施方式实施例11.杉木中转录激活因子的筛选1.1载体的构建本系统筛选载体以pGBKT7(Clontech)为背景，首先将酵母转录抑制因子构建入pGBKT7中GBD的C端，采用的构建方式为将线性化的pGBKT7（引物1：5’-TATGGCCATGGAGGCCGAATTCC-3’; 引物2：5’- TGCAGGTCCTCCTCTGAGATCAGC-3’）与TUP1(引物3：5’- TCAGAGGAGGACCTGCATATG atgactgccagcgtttcgaatacgcag-3’; 引物4：5’- CTCCATGGCCATATG TGCCACGGAAACCTGGGGAGG-3’)通过In-fusion融合成GBD-TUP1。将杉木文库通过In-fusion插入到GBD-TUP1的BamHI 位点（引物5：5’-TATGGCCATGGAGGCCGAATTCC-3’; 引物6：5’- TGCAGGTCCTCCTCTGAGATCAGC-3’），文库大小为2×105。1.2 酵母的转化与筛选酵母的转化参照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual (PT4084-1)_092413, Clontech. 宿主菌株为Gold, 筛选文库大小为2×106。本研究采用的TUP1筛选系统能最大程度分离出转录激活活性极强的基因片段，通过在SD筛选培养基（SD/-His-Ade-Trp, 3-AT, AbA, X-alpha-gal）上的显色反应，鉴定出目的克隆，通过载体引物（T7: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3’; 3’BD: 5’-TTTTCGTTTTAAAACCTAAGAGTC-3’）扩增出目的基因片段，并测序。2.SAC3转录激活功能的鉴定SAC3的转录激活功能用CPRG方法鉴定，将目的片段克隆入pGBKT7中（BamHI位点），并转入酵母Y187中（方法参照1.1），用SD/-Trp培养基筛选出阳性克隆，检测并比较转化菌株的β-galactosidase units （具体方法参照 Yeast Protocols handbook，PT3024-1，Clontech）。3.SAC3转录激活功能域的确定转录激活因子SAC3的功能片段的鉴定同样借助CPRG的方法。首先通过生物信息学手段，预测SAC3可能的功能域，而后分别克隆这些功能域到pGBKT7中（BamHI位点），转入酵母Y187中（方法参照1.1），用SD/-Trp培养基筛选出阳性克隆，检测并比较转化菌株的β-galactosidase units （具体方法参照 Yeast Protocols handbook，PT3024-1，Clontech）。4.植物中SAC3的转录激活功能4.1载体的构建本实验采用GAL4-UAS系统，首先分别构建报告载体和效应载体。报告载体以pGreenII0800为背景在LUC基因序列的5’端插入UAS及迷你35S启动子序列（5’-CGGAGTACTGTCCTCCGCGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGGGATCC-3’），构成UAS-mini35S:: LUC (以35S::REN为内参)；效应载体为35S::GAL4 (DNA-BD) – AD，以pEarlyGate104为背景, 其中GAL4 (DNA-本文档来自技高网...

【技术保护点】
植物源高效转录激活功能域SAC3，其特征在于：所述的SAC3的氨基酸序列为DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQFAVFDDTADSAWDVVNLEAFIDGDYSTSWELETIC。

【技术特征摘要】
1.植物源高效转录激活功能域SAC3，其特征在于：所述的SAC3的氨基酸序列为DEEGCGTCFDFAENTEQKEFLDNWHFEDDFVDYAQF...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏军，冈义人，杨兆河，刘伯斌，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35