一种用于肾透明细胞癌检测的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于肾透明细胞癌检测的试剂盒。肾透明细胞癌是肾癌中比例较高的癌症，但是检测方法具有一定的局限性，不适宜廉价的大面积推广。本发明专利技术提供的试剂盒能够特异性的检测样本中的DUSP‑9蛋白的含量，从而能够快速高效的检测肾透明细胞癌。该试剂盒制备简单，成本低廉，适宜于大面积的推广使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种用于肾透明细胞癌检测的试剂盒。
技术介绍
肾癌又称为肾细胞癌，起源于泌尿小管上皮。肾癌约占成人恶性肿瘤的80％-90％。通常将肾细胞癌分为4型：透明细胞型、颗粒细胞型、混合细胞型、未分化细胞型。其中，肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，CCRCC)占肾癌的70％-80％，其癌细胞常排列成片状、条索状、腺泡状或管状，很像肾小管，早期常无症状，或只有发热、乏力等全身症状，肿瘤体积增大时才被发现(J.C.Cheville,et al.Comparisons of outcome and prognostic features among histologic subtypes of renal cell carcinoma.The American journal of surgical pathology 27(2003)612-624)。肾细胞癌的发病率在过去的30年里一直在稳步上升。由于肾癌缺乏有效的化疗手段，临床目前只能依赖于手术治疗。肾癌不化疗的原因，首先是由于肾癌中一些多药耐药基因的高表达，导致其对化疗药物不敏感，其次虽然化疗在治疗肾癌能快速抑制症状，但是化疗抑制肾癌细胞的同时对正常细胞也会造成损伤，化疗带来的毒副作用多数患者难以忍受，因个体差异，多数患者在化疗过程中会出现全身乏力，容易受感染，倦怠，脱发，机体免疫力下降等。目前靶向治疗肾癌的药物均针对HIFl-α下游靶基因，包括索拉非尼、贝伐珠等药物已用晚期肾癌的靶向治疗并取得一定成绩，但是肾癌的药物治疗效果仍然不尽如人意，主要表现在病情复发、生存率提高甚微、毒副作用大等方面。而癌症在初始期被检测发现之后，对于治疗具有非常重要的意义，据统计，肿瘤在初期被检测发现之后经过治疗，生存期普遍可以提高3-5年左右。DUSP-9(双特异性磷酸酶-9)属于双特异性蛋白磷酸酶亚科。DUSP-9是促分裂原活化蛋白激酶家族中的一个负调节酶(如：ERK,JNK,p38)，它与细胞的增殖和分化相关。大规模平行测序研究已经证明了ccRCC患者中DUSP-9的表达是下调的。并且也证实了DUSP-9是肾透明细胞癌的特异性的标志物。现有技术已经有检测DUSP-9蛋白的量一般通过抗体结合之后通过酶联免疫反应进行定量检测，但是该检测方法需要自备相应的抗体，由于抗体的制备要求比较高，并且制备复杂，在检测中存在着巨大的局限。SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可以从随机单链寡核苷酸库中筛选到特异性与靶物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是体外化学合成一个单链寡核苷酸库，与靶物质混合，形成靶物质-核酸复合物，洗脱未结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸分子，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与靶物质不结合或与靶物质有低亲和力、中亲和力的核酸分子被洗去，而与革G物质有强亲和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数(>90％左右)。自Tuerk和Ellington等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研宄手段和工具。因此，采用selex技术，筛选特定的结合DUSP-9的适配体具有较为重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的技术方案通过以下步骤实现：本专利技术的目的是提供一种DUSP-9的核酸适配体序列。本专利技术中，所述的DUSP-9的核酸适配体(序列1-22)能够特异结合DUSP-9。本专利技术的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本专利技术中根据对该序列应用，可进一步用于制备特异性结合DUSP-9的试剂盒。从体外合成的随机寡聚DNA文库，(5'-TTGACAGGGAGCATTAGCAT-N35-GCATTACCATGAAGTTGCAC-3')，其中N35为35个随机寡核苷酸；从中筛选出与DUSP-9特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物P1：TTGACAGGGAGCATTAGCAT；引物P2：GTGCAACTTCATGGTAATGC，进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并测序反应，上测序仪测序。本专利技术采用核酸适配体的体外筛选(SELEX)技术，以DUSP-9为正筛靶标筛选与DUSP-9特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合DUSP-9的序列，本专利技术中命名为适配体DUSP-9-1～22。序列如下：DUSP-9-1：TTGACAGGGAGCATTAGCATATATAAACCCTCTCTAAACACTTTACACCTTCCCAGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-2：TTGACAGGGAGCATTAGCATCCACCTATCCCCTATCTCTCACTCCCCTATCCACAGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-3：TTGACAGGGAGCATTAGCATATCCACAATTTTAATACAAATCTCTAAATAAACCAGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-4：TTGACAGGGAGCATTAGCATCATCTCCATTTAATCAACACACCTTTTACCTCCAAGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-5：TTGACAGGGAGCATTAGCATTAAACTTAAATCTCAACTCCTACAACACATCCTACGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-6：TTGACAGGGAGCATTAGCATCTACTTAATTACCCCCTCTTCAAACACAATCTATAGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-7：TTGACAGGGAGCATTAGCATTCCCTCTCCTTTCTACATCCCACTACCTATAAATAGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-8：TTGACAGGGAGCATTAGCATACATATCATCTCCCCAATATCCATTATTAACCACTGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-9：TTGACAGGGAGCATTAGCATCCATATTCCACATCTCCATCATATATTTCTACCCCGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-10：TTGACAGGGAGCATTAGCATTCCTCATTTACCCCTATAACTCTCAATACACCCATGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-11：TTGACAGGGAGCATTAGCATCCACACATACACTTACCCTCATTAATATCCATCCTGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-12：TTGACAGGGAGCATTAGCATATCAAAACATCTACTTACCCACTTTCTTTTAATAAGCATTACCATGAAGTTGCAC；DUSP-9-13：TTGACAGGGAGCAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肾透明细胞癌检测的试剂盒，其特征在于其包括能特异性检测肾透明细胞癌的适体。

【技术特征摘要】
1.一种用于肾透明细胞癌检测的试剂盒，其特征在于其包括能特异性检测肾透明细胞癌的适体。2.如权利要求1所述的试剂盒，所述适体为SEQ ID No.1-22任一条序列所示，或者在该序列的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟繁好，
申请(专利权)人：孟繁好，
类型：发明
国别省市：江苏;32