基于电化学检测精子顶体酶活性的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法，其包含：将精子顶体酶底物修饰的电极分别于含有不同浓度精子顶体酶标准样品中充分浸渍，并分别测试所述电极的阻抗，由此建立活性精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；以及，将所述电极分别于含有未知浓度精子顶体酶的待测样品中充分浸渍，并测试所述电极的阻抗，再依据所述标准曲线而获知所述待测试样中精子顶体酶的浓度；其中所述标准样品和待测样品均以适于使精子顶体酶专一结合并水解所述精子顶体酶底物的缓冲液作为溶剂。本发明专利技术还公开了一种试剂盒。藉由本发明专利技术的试剂盒及检测方法，能快速(3min左右)、可靠、灵敏(检测限可达0.001μM)且低成本的检测精子顶体酶的活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种精子顶体酶的活性评价方法，特别是一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法及试剂盒，属于生物检测领域。
技术介绍
顶体酶活性可反映精子质量，顶体酶活力不足可能导致不育，是评价(同意修改)精子功能和生育力强弱的重要指标，结合(同意修改)精液常规分析、精子形态染色等常规指标，能更全面反映精子质量。顶体酶的检测早期多利用顶体酶抗体进行放射免疫法或荧光免疫法检测，通过观察精子顶体内顶体酶的数量判断精子受精能力。后来Kennedy等人首先报道了计算顶体酶水解底物效率的方法判断精子顶体酶的活性，此方法首先将精子裂解，再将裂解液置于加入酶水解底物的检测管中，通过观察底物水解后的显色深浅，计算吸光值检测顶体酶的水解活力。此方法得出指标更能反应精子顶体酶的生理功能，现已成为标准检测方法。近年来又有学者根据精子顶体反应更深入的认识提出，精子顶体酶的活性应由发生顶体反应的精子判断才更符合精子受精的实际生理过程。目前已有报道先进性诱导顶体反应，然后检测发生顶体反应后释放出的顶体酶的活性，以此标示整个精液样本中精子群体的顶体酶活性。然而，目前的检测方法需要借助复杂的仪器，检测花费时间长。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法，其能实现对精子顶体酶快速、灵敏、实时检测，从而克服了现有技术的不足。本专利技术的另一目的在于提供一种精子顶体酶活性检测试剂盒。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法，其特征在于包含：提供精子顶体酶底物修饰的电极，将所述电极分别于含有不同浓度精子顶体酶标准样品中充分浸渍，并分别测试所述电极的阻抗，由此建立活性精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；以及，将所述电极分别于含有未知浓度精子顶体酶的待测样品中充分浸渍，并测试所述电极的阻抗，再依据所述标准曲线而获知所述待测试样中精子顶体酶的浓度；其中，所述标准样品和待测样品均以适于使精子顶体酶专一结合并水解所述精子顶体酶底物的缓冲液作为溶剂。进一步的，所述基于电化学检测精子顶体酶活性的方法还包括：以选定官能团修饰所述电极表面而形成复数个精子顶体酶底物的结合位点。一种精子顶体酶活性检测试剂盒，其包括：精子顶体酶底物修饰的电极，适于使精子顶体酶专一结合并水解所述精子顶体酶底物的缓冲液，其中，当所述电极被浸于所述缓冲液中时，所述电极的阻抗变化幅度与所述缓冲液中精子顶体酶的浓度变化幅度呈正比。进一步的，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书记载的所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：将所述电极分别于含有不同浓度精子顶体酶标准样品中充分浸渍，并分别测试所述电极的阻抗，由此建立活性精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；以及，将所述电极分别于含有未知浓度精子顶体酶的待测样品中充分浸渍，并测试所述电极的阻抗，再依据所述标准曲线而获知所述待测试样中精子顶体酶的浓度；其中，所述标准样品和待测样品均以所述缓冲液作为溶剂。进一步的，所述精子顶体酶底物物理吸附或偶联于所述电极表面。进一步的，所述电极包括金电极。进一步的，所述精子顶体酶底物包括ZP3蛋白。在一实施方案之中，所述基于电化学检测精子顶体酶活性的方法包括：将具有洁净表面的金电极于胱氨二盐酸盐溶液中充分浸渍后取出、干燥，再浸入含戊二醛和精子顶体酶底物的缓冲溶液，之后晾干，获得精子顶体酶底物修饰的电极。进一步的，所述缓冲液采用磷酸缓冲盐溶液。藉由本专利技术的试剂盒及检测方法，能快速(3分钟左右)、可靠、灵敏(检测限可达0.001μM)且低成本的检测精子顶体酶的活性。附图说明图1是本专利技术一典型实施方案之中在金电极表面修饰精子顶体酶底物的原理图；图2是本专利技术一典型实施方案之中以精子顶体酶底物修饰的金电极检测精子顶体酶的示意图；图3是本专利技术一典型实施方案之中以精子顶体酶底物修饰的金电极检测精子顶体酶的检测结果曲线图。具体实施方式如前所述，鉴于现有技术的诸多缺陷，本案专利技术人经长期研究和大量实践，非常惊奇的发现，当以电极，特别是金电极作为任一种精子顶体酶底物的载体时，其阻抗大小会被周围环境的介电常数显著影响，特别是，当存在有活性精子顶体酶(即使是非常少量的、浓度在nM级别)时，载于金电极上的精子顶体酶底物被活性精子顶体酶底物水解时，金电极的阻抗会相应发生非常剧烈的变化，基于这一意外发现，本案专利技术人得以提出本专利技术的技术方案，即提供了一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法及试剂盒，并经大量实验验证了其效果。进一步的，本专利技术的一个方面所提供的一种试剂盒包括：精子顶体酶底物修饰的电极，以及，适于使活性精子顶体酶与所述精子顶体酶底物与专一结合并水解的缓冲液。本专利技术中的电极，其主要作用是将底物被酶水解过程的生物或者化学信号转变成电信号，应当能够高效稳定的固定精子顶体酶底物并且不影响精子顶体酶的活性，其他任何满足该条件的材料都可以用来作为电极。在一实施方案之中，所述电极优选采用金电极，其具有较好的生物相容性好，作为电极材料能保证精子顶体酶底物以及精子顶体酶的活性。在本专利技术的一实施方案之中，所述精子顶体酶底物可通过物理方式或化学反应修饰在金电极表面。在一较为优选的方案之中，可先以选定官能团对金电极表面进行修饰，以在金电极表面提供大量的可以与精子顶体酶蛋白结合的位点，继而，精子顶体酶底物可以通过物理方式或与修饰在金电极表面的官能团反应(特别是偶联反应)，尤其优选通过后一种方式而固定在金电极的表面。其中，用于将精子顶体酶底物修饰在金电极上的官能团可来源于任何合适的而不限于某
些特定的偶联物质，本领域技术人员依据本说明应当能够很容易的理解，凡是能修饰在金电极表面并能与精子顶体酶底物作用的官能团都是适用的。较为优选的，可以采用胱氨二盐酸盐，其优点在于：a、其具有良好的生物相容性和水溶性，不会破坏精子顶体酶和精子顶体酶地物的活性；b、可以通过金硫酸键(Au-S)和金电极结合，并且可以提供大量的氨基。本专利技术中所采用的精子顶体酶底物可以是能与精子顶体酶反应(例如水解)的任何合适种类，例如ZP3蛋白等，其主要特点是能与精子顶体酶专一结合，任意一种精子顶体酶底物都可以用来修饰所述电极。本专利技术中所采用的缓冲液可以是PBS缓冲液等，其pH值优选为7左右。本专利技术的另一个方面提供的一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法主要包括：提供精子顶体酶底物修饰的电极；绘制精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；对含有精子顶体酶的样品进行交流阻抗分析，得到其阻抗，根据所述标准曲线计算待测样品中的精子顶体酶的浓度，实现对精子顶体酶快速、灵敏、实时检测。在本专利技术的一实施方案之中，该方法可以包含：将所述电极分别于含有不同浓度精子顶体酶标准样品中充分浸渍，并分别测试所述电极的阻抗，由此建立活性精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；以及，将所述电极分别于含有未知浓度精子顶体酶的待测样品中充分浸渍，并测试所述电极的阻抗，再依据所述标准曲线而获知所述待测试样中精子顶体酶的浓度；其中，所述标准样品和待测样品均以适于使精子顶体酶专一结合并水解所述精子顶体酶底物的缓冲液作为溶剂。在一更为具体的实施方案之中，一种基于电化学检测精子顶体酶活性的方法具体可以包括：a.制备功能化的金电极；b.通过化学或者物理方法将精子顶体酶高效固定在金本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种精子顶体酶活性检测试剂盒，其特征在于包括：精子顶体酶底物修饰的电极，适于使精子顶体酶专一结合并水解所述精子顶体酶底物的缓冲液，其中，当所述电极被浸于所述缓冲液中时，所述电极的阻抗变化幅度与所述缓冲液中精子顶体酶的浓度变化幅度呈正比。

【技术特征摘要】
1.一种精子顶体酶活性检测试剂盒，其特征在于包括：精子顶体酶底物修饰的电极，适于使精子顶体酶专一结合并水解所述精子顶体酶底物的缓冲液，其中，当所述电极被浸于所述缓冲液中时，所述电极的阻抗变化幅度与所述缓冲液中精子顶体酶的浓度变化幅度呈正比。2.根据权利要求1所述的精子顶体酶活性检测试剂盒，其特征在于还包括说明书，所述说明书记载的所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：将所述电极分别于含有不同浓度精子顶体酶标准样品中充分浸渍，并分别测试所述电极的阻抗，由此建立活性精子顶体酶浓度与电极阻抗的标准曲线；以及，将所述电极分别于含有未知浓度精子顶体酶的待测样品中充分浸渍，并测试所述电极的阻抗，再依据所述标准曲线而获知所述待测试样中精子顶体酶的浓度；其中，所述标准样品和待测样品均以所述缓冲液作为溶剂。3.根据权利要求1所述的精子顶体酶活性检测试剂盒，其特征在于所述精子顶体酶底物物理吸附或偶联于所述电极表面。4.根据权利要求1-3中任一项所述的精子顶体酶活性检测试剂盒，其特征在于所述电极包括金电极，所述精子顶体酶底物包括ZP3蛋白。5.根据权利要求1-3中任一项所述的精子顶体酶活性检测试剂盒，其特征在于所述缓冲液采用磷酸缓冲盐溶液。6.一种基于电化学...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄又举，陈涛，荣运，
申请(专利权)人：中国科学院宁波材料技术与工程研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33