本发明专利技术涉及生物技术和医学检测领域，旨在提供一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒中包括下述组分：AMA‑M2标准品；M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的抗人IgG；样本稀释液：质量浓度0.1％的BSA‑PBS溶液；辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。本发明专利技术所用试剂盒使用更为简便，能够直接检测体检者唾液中的AMA‑M2表达水平，是一种无创的检测手段，解决了血液途径检测存在的不足。本发明专利技术能够更加安全、方便、快捷地应用于PBC的筛查，辅助PBC的诊断，为后期疾病的治疗和改善患者预后提供数据支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和医学检测领域，具体为唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒，旨在建立一种快速、无创检测人体内AMA-M2水平的技术。
技术介绍
酶联免疫吸附实验法(ELISA)是分析化学领域中较为成熟的技术之一，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种免疫测定技术。该技术采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测量时，抗原(抗体)先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物)，此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比。这种有色产物可用酶标仪加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强，敏感度高，易于推广。PBC是一种自身免疫性肝病，主要表现为肝内小胆管的进行性破坏，最终导致肝硬化，甚至肝衰竭，严重危害人类健康。因PBC发病隐匿，疾病的早期筛查、早期发现和早期处理，对PBC的治疗和病人的预后十分重要。抗线粒体抗体(AMA)，特别是抗线粒体抗体M2型(AMA-M2)，是PBC的特异性血清学标志，其特异度和灵敏度都高达95％以上，是目前临床用于诊断PBC的重要指标。现有的血液检测技术虽十分成熟，但其自身有一定的局限性：1、首先血液的获取是一种有创的手段，样本的获取需要有专业的技术；2、血液获取过程中，受试者易产生不适感和一定感染风险；3、血液样本的获取和处理成本较高。正因为这些缺陷的存在，血液检测并不利于原发性胆汁性肝硬化的大规模筛查，寻找一种无创便捷的介质进行AMA-M2检测是十分必要的。唾液是一种无色且稀薄的液体，唾液中含有电解质，蛋白质，酶，细胞因子等成分。唾液主要由唾液腺分泌，而外周血中的成分可以通过被动扩散，主动运输，超滤等方式进入唾液。因此，唾液可以在一定程度上反映外周血的情况，而且唾液的获取具有无创，易获得，技术要求低，成本低等诸多优势，是一种理想的血清替代品。目前，用于检测AMA-M2局限于血液途径，利用唾液进行AMA-M2检测的试剂盒和方法还没出现。本专利技术主要是利用改良的AMA-M2检测试剂盒进行唾液中AMA-M2检测的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒。为解决技术问题，本专利技术的解决方案是：提供一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒中包括下述组分：AMA-M2标准品；M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；酶标二抗：辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG；样本稀释液：质量浓度0.1％的BSA-PBS溶液；辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。本专利技术中，所述样本稀释液的配制方法为：取牛血清白蛋白1g，加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L，充分溶解。本专利技术中，所述底物显色液为TMB/H2O2，是通过下述方法配制获得：(1)配制底物显色液A：取四甲基联苯胺(TMB)20mg、DMSO 2ml、EDTA-Na 20mg、柠檬酸95mg、甘油5ml，以ddH2O定容至50ml后混匀，避光保存；(2)配制底物显色液B：取醋酸钠1.36g、柠檬酸0.16g、30％过氧化氢(H2O2)30ul，以ddH2O定容至50ml后混匀；(3)使用前，将底物显色液A、B液等体积混匀，即得底物显色液TMB/H2O2。本专利技术中，所述反应终止液为：0.5M硫酸。本专利技术中，所述清洗缓冲液是质量浓度0.05％的Tween20-PBS溶液；其配制方法为：取吐温20500ul，加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L，充分溶解。本专利技术进一步提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)将获取的唾液样本离心后吸取上清，用0.1％BSA-PBS溶液按1∶40的体积比稀释；(2)用0.1％BSA-PBS溶液稀释AMA-M2标准品为8个梯度：AMA-M2含量分别为：1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml；第8个(0RU/ml)设为空白对照孔，直接采用样本稀释液；(3)在M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品和样本，室温孵育30分钟；弃去孔中液体，每孔加300ul配好洗液，60秒后将微孔板中液体倒出，并在吸水纸上拍打去除残留液体，重复清洗3次；(4)每孔加入100ul酶标二抗，室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，清洗3次；(5)每孔加入100ul显色液，室温孵育15分钟，再以加显色液的相同顺序加入100ul终止液终止反应；(6)用酶标仪在450nm波长读取OD值，以450nm平均吸光值为横坐标，各标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线换算出样本中AMA-M2浓度。与现有技术相比，本专利技术的技术效果在于：本专利技术所用试剂盒使用更为简便，能够直接检测体检者唾液中的AMA-M2表达水平，是一种无创的检测手段，解决了血液途径检测存在的不足。本专利技术能够更加安全、方便、快捷地应用于PBC的筛查，辅助PBC的诊断，为后期疾病的治疗和改善患者预后提供数据支持。附图说明图1为改良的ELISA试剂盒检测健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表达水平标准曲线图；图2为改良的ELISA试剂盒检测健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表达水平图；图3为改良的ELISA试剂盒检测健康人和PBC病人唾液中AMA-M2表达水平ROC曲线图。具体实施方式下面结合具体实施进一步阐述本专利技术，应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围。本专利技术实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。统计学方法：采用SPSS19.0统计分析软件分析，各样本均数的比较采用t检验分析，样本之间相关性分析采用pearson相关分析。唾液样本采集管均购自BD公司，离心管和离心机购自Thermo公司，牛血清白蛋白(BSA)购自Amresco公司，酶标仪购自Bio-Rad公司。AMA-M2标准品、M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板和酶标二抗均可通过正常的商业渠道获得。实施例1试剂盒灵敏度考察：A：将AMA-M2标准品用样本稀释液(0.1％BSA-PBS溶液)倍比稀释(1∶2体积比)成8个梯度，使AMA-M2含量分别为：1RU/ml、0.50RU/ml、0.25RU/ml、0.125RU/ml、0.0625RU/ml、0.03175RU/ml、0.015625RU/ml、0RU/ml的标准品；其中第8个(0RU/ml)设为空白对照孔，直接为样本稀释液。B：抗原-抗体反应，在所述M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板中分别加入100ul稀释好的标准品(标准品两列，各设1复空)，室温孵育30分钟后，弃去孔中液体，每孔加300ul配好洗液，60秒后将微孔板中液体倒出，并在吸水纸上拍打去除残留液体，重复清洗3次。C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括下述组分：AMA‑M2标准品；M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的抗人IgG；样本稀释液：质量浓度0.1％的BSA‑PBS溶液；辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。
【技术特征摘要】
1.一种唾液抗线粒体抗体M2型的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括下述组分：AMA-M2标准品；M2抗原包被的聚苯乙烯ELISA微孔板；酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的抗人IgG；样本稀释液：质量浓度0.1％的BSA-PBS溶液；辅助试剂：底物显色液、反应终止液和清洗缓冲液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液的配制方法为：取牛血清白蛋白1g，加入pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲溶液1L，充分溶解。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为TMB/H2O2，是通过下述方法配制获得：(1)配制底物显色液A：取四甲基联苯胺20mg、DMSO 2ml、EDTA-Na 20mg、柠檬酸95mg、甘油5ml，以ddH2O定容至50ml后混匀，避光保存；(2)配制底物显色液B：取醋酸钠1.36g、柠檬酸0.16g、30％过氧化氢30ul，以ddH2O定容至50ml后混匀；(3)使用前，将底物显色液A、B液等体积混匀，即得底物显色液TMB/H2O2。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反应终止液为：0.5M硫酸。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗缓冲液是质量浓度0.05％的Tween20-PBS溶液；其配制方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：刁宏燕，卢翀，陈佳宁，侯显良，王琳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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