一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用技术

一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用，该方法将ACDM与白蛋白特异性结合并形成荧光缀合物，该缀合物在pH值1-9的条件下可被激发产生稳定的荧光信号，其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出生物样品中白蛋白的含量。该方法可用于测定血浆、尿液、细胞培养液等多种生物样品中白蛋白的绝对含量，同时还具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测等优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药
，具体涉及一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用。
技术介绍
人血浆白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白，约占到血浆中蛋白总量的50–60％【Biochem.Pharmacol.2005,70，1673】。人白蛋白是由肝脏合成的非糖基化单链蛋白，血液中浓度可以达到35-55mg/mL。人血清白蛋白在维持人体健康中发挥着不可替代的重要作用，其不仅能维持血液正常的渗透压，还肩负运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多药物分子的重任，同时还具有抗氧化、清除毒物等作用【Nat.Struct.Biol.1998,5,827】。白蛋白的多个位点可结合各类内源性及外源性物质，从而影响上述物质在体内的转运及处置。多种疾病，比如肝病(尤其是肝硬化)、肾病综合症、肿瘤、蛋白丢失性肠病、烧伤以及营养不良等会导致血清白蛋白的水平下降，而高蛋白饮食以及慢性脱水则会造成白蛋白水平升高。因此人血中白蛋白含量的定量测定已作为临床常规检测项目并被广泛用于多种疾病的辅助诊断。大量临床实践已证实，监测血中白蛋白水平对于肝肾功能异常患者的早期诊断以及疾病的愈后都有十分重要的诊断参考价值。更为重要的是，尿液中出现微量白蛋白一般可作为肾脏疾病(如糖尿病、高血压、链球菌感染后的肾小球肾炎)、血管内皮功能障碍、心脏疾病以及静脉血栓栓塞的标志物及诊断指标【J.Am.Soc.Nephrol.2006,17,2120】。此外，血浆及白蛋白制品在存放和运输过程中往往会造成部分白蛋白变性从而给患者带来不可预料的后果。因此，准确评判血浆及白蛋白制品的质量对于临床治疗也具有重要意义。目前，白蛋白的检测和定量方法包括：电泳法、免疫法和染料结合法等方法。其中电泳法耗时耗力，特异性较差，易造成白蛋白浓度的高估【Clinical Chemistry:Theory,Analysis,Correlation,Mosby,5th edition,2009】。而免疫法虽然其特异性较好，但成本较高，因此目前临床应用较少。染料结合显色法应用相对较为广泛，溴甲酚绿(bromocresol green)和溴甲酚紫(bromocresol purple)作为简单、便宜且特异性相对较好的两种染料分子，在临床上被较多的用来定量白蛋白。但由于这两种染料的灵敏度较低、无法保证定量的准确性，常出现高估【J Clin Pathol.2003,56,780.】或低估现象【Clin.Chim.Acta.1986,155,83.】，且不可避免受到生物样品中的非特异性干扰【Clin.Chem.2009,55,583.】。本专利技术提到的方法属于染料结合法，相比于目前的几种染料，其具有简单易操作、特异性高、准确可靠等特点。本专利技术提供了一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及应用，具体为ACDM可与白蛋白特异性结合生成荧光缀合物。该荧光缀合物在生理pH值条件下被激发后(激发波长λex＝560nm)产生稳定的荧光信号(发射波长λem＝612nm)。其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出生物样品中白蛋白的含量。该方法可用于测定血浆、尿液、细胞培养液等多种生物样品中白蛋白的绝对含量，同时还具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测等优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种定量测定生物样品中白蛋白含量的方法及其应用。具体为ACDM可与白蛋白特异性结合生成荧光缀合物。该荧光缀合物在生理pH值条件下被激发后(激发波长λex＝560nm)产生稳定的荧光信号(发射波长λem＝612nm)。其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可
推算出生物样品中白蛋白的含量。该方法可用于测定血浆、尿液、细胞培养液等多种生物样品中白蛋白的绝对含量，同时还具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测等优势。一种定量测定生物样品中白蛋白的方法，将ACDM与白蛋白特异性结合并形成荧光缀合物，该缀合物在pH值1-9的条件下可被激发产生稳定的荧光信号，其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出生物样品中白蛋白的含量；反应式如下：该方法具体按照以下步骤进行：(1)A液配制：配制pH 5.5-9.5磷酸盐缓冲液0.1M，(2)将待测样本加入A液中混匀并孵育1-3min，孵育温度为0-60℃，(3)B液配制：以ACDM作为特异性结合配体，配制2mM的ACDM溶液，溶剂选择二甲基亚砜、甲醇或乙腈；(4)样本测定：将步骤(2)中孵育好的溶液加入B液，混匀后用荧光检测仪检测，激发波长560nm，发射波长612nm；读取荧光值；同步测定无待测样本的本底荧光值；(5)标准曲线绘制：配制不同浓度的白蛋白标准曲线工作液(0,5,10,20,50,75,100,200,300,400mg/L)，采用上述流程测定其荧光值并绘制标准曲线；(6)将样本实测值代入标准曲线换算白蛋白的含量。质控液配制：配制50mg/L的白蛋白标准液(溶于缓冲液中)作为质控样本，
定期进行方法质控。所述磷酸盐缓冲液pH优选7.4；孵育温度优选为37℃。一种定量测定生物样品中白蛋白的方法的应用，该方法可用于多种白蛋白类产品的质量控制，包括重组表达的白蛋白、白蛋白注射液及含有白蛋白的制剂等各类医药产品。一种定量测定生物样品中白蛋白的方法的应用，该方法可用于临床样本的体外常规检验，包括人血浆、尿液等临床样品中白蛋白含量的定量测定。一种定量测定生物样品中白蛋白的方法的应用，该方法可用于体外定量评判肝细胞合成白蛋白的功能。该方法检测原理如下：在生理pH条件下，一分子ACDM与一分子白蛋白特异性结合后产生一分子荧光缀合物，其荧光强度与白蛋白的含量成正比。该方法具有荧光强度增益明显，检测灵敏度高、适于高通量检测等特点。本专利技术提供的白蛋白定量测定方法借助荧光检测仪实现不同生物样品中目标蛋白的快速超灵敏检测，该方法可用于重组表达的白蛋白、含有白蛋白的各类医药产品、人血浆、尿液等临床样品、体外人肝细胞中白蛋白的定量测定。本专利技术所述白蛋白的定量检测方法具有以下突出优势：(1)高特异性：该方法具有良好的特异性(如图1所示)，ACDM可与白蛋白高特异性地结合成荧光缀合物(如图4所示)；(2)高灵敏度：ACDM具有良好的荧光发射光谱特性(560nm)，该底物与白蛋白结合产物具有荧光发射光谱特征，能较好的进行检测(如图4所示)。(3)易高通量检测：该方法可在实验室常见各类荧光酶标仪及临床大生化仪上测定，可利用96或386微孔板进行批量检测。(4)抗干扰能力强：内源性物质与离子等对该方法定量的影响较小(如图3
所示)。附图说明图1.特异性筛选结果；图2.ACDM与白蛋白的结合动力学；图3.抗离子及内源性物质干扰试验结果；图4.ACDM-白蛋白缀合物的荧光发射光谱图(激发波长560nm)；图5.白蛋白定量标准曲线。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。所述B液：以ACDM作为特异性结合配体，配制2mM的ACDM溶液，溶剂选择二甲基亚砜、甲醇或乙腈。实施例1.检测方法的特异性(1)含有转铁蛋白、肌红蛋白、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量测定生物样品中白蛋白的方法，其特征在于：将ACDM与白蛋白特异性结合并形成荧光缀合物，该缀合物在pH值1‑9的条件下可被激发产生稳定的荧光信号，其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出生物样品中白蛋白的含量；反应式如下：

【技术特征摘要】
1.一种定量测定生物样品中白蛋白的方法，其特征在于：将ACDM与白蛋白特异性结合并形成荧光缀合物，该缀合物在pH值1-9的条件下可被激发产生稳定的荧光信号，其荧光值强度与白蛋白的浓度成正比，根据检测到的荧光值可推算出生物样品中白蛋白的含量；反应式如下：2.如权利要求1所述的一种定量测定生物样品中白蛋白的方法，其特征在于具体按照以下步骤进行：(1)A液配制：配制pH 5.5-9.5磷酸盐缓冲液0.1M；(2)将待测样本加入A液中混匀并孵育1-3min，孵育温度为0-60℃；(3)B液配制：以ACDM作为特异性结合配体，配制2mM的ACDM溶液，溶剂选择二甲基亚砜、甲醇或乙腈；(4)样本测定：将步骤(2)中孵育好的溶液加入B液，混匀后用荧光检测仪检测，激发波长560nm，发射波长612nm；读取荧光值；同步测定无待测样本的本底荧光值；(5)标准曲线绘制：配制不同浓度的白蛋白标准曲线工...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨凌，崔京南，王一儒，葛广波，冯磊，金强，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21