一种测定水样中细菌密度的方法技术

本发明专利技术提供了一种测定水样中细菌密度的方法，其包括如下步骤：采用微孔滤膜过滤待测水样，使用核酸染色剂对过滤完毕的微孔滤膜在避光条件下进行染色，并测定染色后的微孔滤膜的荧光强度，然后根据表示了细菌数量与荧光强度对应关系的线性回归方程计算出待测水样的细菌数量，细菌密度等于细菌数量与待测水样的体积之商；本发明专利技术无需对待测水样中的细菌进行长时培养即可快速得到该待测水样的细菌密度，并且能够同时对多个待测水样进行批量测定，有效地缩短了检测时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细菌密度检测
，涉及一种测定水样中细菌密度的方法。
技术介绍
诸如江水、河水、湖水、工业用水、生活饮用水及海水等水体中的细菌密度是评价其洁净程度的重要指标。目前测定上述水体中的细菌密度的常规方法是先采集水样，然后在实验室中分类培养，待培养出肉眼可见的菌落之后再进行测定。然而，培养到肉眼可见的菌落至少需要1‐15天时间(根据细菌的种类而定)，耗时较长且操作繁琐；另外，在培养的过程中容易感染杂菌，不仅影响测定结果，对操作人员的技术水平要求高，而且该测定方法还受限于实验室的培养环境；再者，能够进行人工培养的细菌仅占细菌种类总数的极少一部分，因此，上述的方法对细菌种类的要求较高，故需要建立一套简便、灵敏，快速的检测水样中细菌密度的方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种快速测定水样中细菌密度的方法。为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：一种测定水样中细菌密度的方法，其包括如下步骤：采用微孔滤膜过滤待测水样，使用核酸染色剂对过滤完毕的微孔滤膜在避光条件下进行染色，并测定染色后的微孔滤膜的荧光强度，然后根据表示了细菌数量与荧光强度对应关系的线性回归方程计算出待测水样的细菌数量，细菌数量与待测水样的体积的商即细菌密度。其中，上述的微孔滤膜的孔径可以为0.22μm。上述的核酸染色剂可以为9green fluorescent nucleic acid stains(Molecular Probes,Leiden,Netherlands)。上述的荧光强度的测定方法为：在25℃下用470nm的激发光照射染色后的微孔滤膜，然后测定其在510nm处的荧光强度。上述的线性回归方程的构建方法包括如下步骤：(1)、获取多个具有不同的细菌总数的含菌溶液；(2)、采用多个微孔滤膜对每一个含菌溶液一一对应进行过滤；(3)、使用核酸染色剂对每一个过滤完毕后的微孔滤膜在避光条件下进行染色；(4)、测定空白的微孔滤膜以及所有的染色后的微孔滤膜的荧光强度；(5)、对微孔滤膜的荧光强度和细菌总数的关系进行曲线拟合，得到线性拟合曲线并获得对应的线性回归方程。其中，含菌溶液的细菌密度可以为102、103、104、105、106、107或108个/mL，体积可以为1‐10mL。由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：本专利技术先采用特定的微孔滤膜过滤待测水样，使该待测水样中的细菌全部富集在微孔滤膜上，然后使用核酸染色剂对过滤完毕的微孔滤膜在避光条件下进行染色并测定荧光强度，再根据表征细菌数量与荧光强度对应关系的线性回归方程计算出待测水样的细菌数量，最后根据细菌数量与待测水样的体积之商得到细菌密度。由于待测水样中的细菌全部富集在微孔滤膜上，使得该微孔滤膜上的细菌数量足以达到荧光定量检测的检测下限，因此，本专利技术无需对待测水样中的细菌进行培养即可通过荧光定量检测快速得到该待测水样的细菌密度，具有较高的灵敏度，并且不易受到样品中干扰荧光测定的因素的影响。另外，微孔滤膜可以剪裁成同样的大小，并可以通过酶标仪对多片剪裁后的滤膜同时进行荧光强度测定，因此，本专利技术能够同时对多个待测水样进行批量测定，有效地缩短了检测时间。具体实施方式本专利技术提供了一种测定水样中细菌密度的方法，其包括如下步骤：(1)、获取一定体积的待测水样，采用微孔滤膜过滤该待测水样，得到过滤完毕的微孔滤膜，并弃去过滤液；(2)、使用核酸染色剂对过滤完毕的微孔滤膜在避光条件下进行染色，获得染色后的微孔滤膜；(3)、测定染色后的微孔滤膜的荧光强度；(4)、根据表示细菌数量与荧光强度的对应关系的线性回归方程计算出待测水体的细菌数量；(5)、通过以下公式计算出待测水样的细菌密度：细菌密度＝计算出的细菌数量/待测水样的体积。其中，在步骤(1)中，待测水样可以为河水、湖水、工业用水、生活饮用水及海水等，其体积可以为100‐1000mL，该体积根据该待测水样的预估含菌量或洁净度进行确定。在步骤(1)中，微孔滤膜的孔径为0.22μm(PTFE membranes，Millipore,UK Ltd)。该微孔滤膜可以截留细菌，使细菌富集在微孔滤膜上而不会透过该微孔滤膜的微孔。在步骤(1)中，微孔滤膜应事先经过灭菌处理，以防微孔滤膜表面上的杂菌干扰测定结果。在步骤(1)中，过滤可以采用重力过滤，也可以采用真空抽滤。在步骤(2)中，核酸染色剂为9green fluorescent nucleic acid stains(Molecular Probes,Leiden,Netherlands)。该核酸染色剂是一种能够与细菌细胞内的核酸结合的荧光染料。当核酸染色剂与细菌细胞内的核酸结合后，在波长为470nm的激发光的激发下，该核酸染色剂能发射出荧光，所发射出的荧光的强度与所结合的核酸的数量成正比，因此，可以通过测定荧光强度来推算出细菌的数目。为了确保核酸染色剂能够与所有细菌的核酸结合，核酸染色剂的用量应该是过量的。在步骤(2)中，染色的时间为5±1min。在步骤(2)中，染色完毕后需洗去未结合的核酸染色剂，从而防止出现假阳性。在步骤(3)中，荧光强度的测定方法为：在25℃下用470nm的激发光照射染色后的微孔滤膜，然后测定其在510nm处的荧光强度。在步骤(3)中，荧光强度可以通过酶标仪进行测定。此时，需要将直径为R的微孔滤膜剪成直径为r＝0.5cm的圆形滤膜。因为酶标仪测得的仅为直径为r＝0.5cm的圆形滤膜的荧光强度Dr，所以还需要计算出直径为R的微孔滤膜的荧光强度DR。考虑到直径为R的微孔滤膜上的细菌是均匀分布的，因此，直径为R的微孔滤膜的荧光强度在步骤(4)中，线性回归方程的构建方法包括如下步骤：(4‐1)、获取多个具有不同的细菌总数的含菌溶液；(4‐2)、采用多个微孔滤膜对多个含菌溶液一一对应进行过滤，得到多个过滤完毕的微孔滤膜，并弃去过滤液；(4‐3)、使用核酸染色剂对每一个过滤完毕的微孔滤膜在避光条件下进行染色，得到多个染色后的微孔滤膜；(4‐4)、测定空白的微孔滤膜以及所有的染色后的微孔滤膜的荧光强度；(4‐5)、以荧光强度为横坐标，以细菌总数为纵坐标，对上述各个微孔滤膜的荧光强度和细菌总数的对应关系进行曲线拟合，得到线性拟合曲线并获得对应的线性回归方程。其中，在步骤(4‐1)中，为了确保线性回归方程的准确性，含菌溶液的数量越多越好。在步骤(4‐1)中，含菌溶液的细菌总数可以通过含菌溶液的体积和其中所含的细菌的密度加以控制。含菌溶液的体积可以为1‐10mL。含菌溶液的细菌密度可以为102、103、104、105、106、107或108个/mL。可以固定含菌溶液的体积，根据细菌总数的不同配置成具有不同细菌密度的含菌溶液。例如，可以固定含菌溶液的体积为1mL，从而配置成密度为102、104和108个/mL的含菌溶液作为标准溶液。在步骤(4‐2)中，微孔滤膜的孔径应为0.22μm，并且需要事先经过灭菌处理，以防微孔滤膜表面上的杂菌干扰测定结果。在步骤(4‐2)中，所采用的过滤方式应该与实际测定时的过滤方式一样，以便尽可能地减少由于过滤方式不一样而导致的系统误差。在步骤(4‐2)中，所采用的核酸染色剂也应该与实际测定时的核酸染色剂的种类一样。实施例一本实施例提供了一种测定河水中的细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定水样中细菌密度的方法，其特征在于：包括如下步骤：采用微孔滤膜过滤待测水样，使用核酸染色剂对过滤完毕的微孔滤膜在避光条件下进行染色，并测定染色后的微孔滤膜的荧光强度，然后根据表示了细菌数量与荧光强度对应关系的线性回归方程计算出所述待测水样的细菌数量，细菌数量与待测水样的体积的商即细菌密度。

【技术特征摘要】
1.一种测定水样中细菌密度的方法，其特征在于：包括如下步骤：采用微孔滤膜过滤待测水样，使用核酸染色剂对过滤完毕的微孔滤膜在避光条件下进行染色，并测定染色后的微孔滤膜的荧光强度，然后根据表示了细菌数量与荧光强度对应关系的线性回归方程计算出所述待测水样的细菌数量，细菌数量与待测水样的体积的商即细菌密度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核酸染色剂为9green fluorescent nucleic acid stains(Molecular Probes,Leiden,Netherlands)。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光强度的测定方法为：在25℃下...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，漆晴，
申请(专利权)人：吴江华衍水务有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32