一种弗氏链霉菌固体培养基、培养方法及农用微生物菌剂的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种弗氏链霉菌固体培养基、培养方法及农用微生物菌剂的制备方法，属于微生物发酵领域。以重量计，弗氏链霉菌固体培养基包括3～10份玉米粉、3～18份豆粕粉、18～45份秸秆粉、10～30份草炭土、20～50份磷尾矿、1～10份碳酸钙和40～50份营养液。利用该固体培养基，本发明专利技术通过液‑固双相发酵制备固体发酵培养基，并用于生产农用弗氏链霉菌菌剂。本发明专利技术提供的弗氏链霉菌产孢的发酵培养基适于弗氏链霉菌的生长，每克发酵原料可产生7.5*109以上个孢子；制备的孢子粉萌发率可达95％，所制备的农用微生物菌剂符合农用微生物菌剂的国家标准，对作物的生长具有明显促进作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵领域，特别地，涉及一种弗氏链霉菌固体培养基，及其制备和发酵方法，以及利用该培养基制备农用弗氏链霉菌菌剂的方法。
技术介绍
链霉菌(Streptomycetaceae)是抗生素类物质的主要生产菌，在微生物产生的20000多种活性物质中，链霉菌占到60％以上，是一类作物有益菌，在农业病害的生物防治上具有广阔的应用前景。弗氏链霉菌作为链霉菌属(Streptomyces)的一个种类，可产生泰乐霉素、新霉素等有效活性成分，对作物具有明显的促生、抗病作用，越来越多地被应用于果树、蔬菜等多种作物栽培中。但是，土壤中自然生长的弗氏链霉菌数量太少，无法发挥上述作用。而现有技术中弗氏链霉菌多为液体发酵，发酵周期长、产孢量少，难以满足其作为农用微生物菌剂的工业化生产的要求。中国专利CN 102329754 B公开了一种弗氏链霉菌新菌株的菌剂制备方法，包括先制备弗氏链霉菌新菌株的种子液，再将种子液转接到固体增殖培养基上培养7-10天后，经干燥获得弗氏链霉菌新菌株原菌菌剂。该菌剂的制备方法采用液体+固体联合发酵工艺进行菌种增殖，所制备菌剂中含有效活菌数为50亿/g以上，与传统的液体发酵吸附成固体制剂的方式相比，产孢量更高，代谢产物量大，其产品的生物活性更好，保存期更长。但是，该专利技术也存在缺点，譬如，其液体培养基和固体培养基的原料来源单一，养分不够丰富，造成菌种生长缓慢，菌剂生产周期长，从菌种的活化到固体发酵结束后干燥得到菌剂原液，需要30天左右，限制了其产业化生产。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种弗氏链霉菌固体培养基及其制备和发酵方法，以及利用该培养基制备农用弗氏链霉菌菌剂的方法，以解决现有技术中液体发酵弗氏链霉菌产孢量少、发酵周期长、难以制备农用固体微生物菌剂，以及有效利用磷矿资源的技术问题。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种弗氏链霉菌固体培养基，以重量份计，包括：3～10份玉米粉、3～18份豆粕粉、18～45份秸秆粉、10～30份草炭土、20～50份磷尾矿、1～10份碳酸钙、40～50份营养液。根据本专利技术优选的，所述秸秆粉的粒径细度优选为30-50目；所述草炭土细度为40目；所述磷尾矿粉颗粒细度在80目以下；所述培养基的有机质含量≥60％。根据本专利技术优选的，以重量份计，所述营养液包括1～10份的蔗糖、1～5份的硫酸铵、0.1～1份磷酸二氢钾、85～92份水。根据本专利技术优选的，培养基以重量份计，包括：5～10份的玉米粉、8～10份的豆粕粉、18～25份的秸秆粉、20～30份的草炭土、30～40份的磷尾矿、2～3份的碳酸钙和43～48份蔗糖-硫酸铵营养液。更进一步地，培养基包括以下重量份计的原料：10份玉米粉、10份豆粕粉、18份秸秆粉、30份草炭土、30份磷尾矿、2份碳酸钙和45份蔗糖-硫酸铵营养液。更进一步地，培养基包括以下重量份计的原料：7份玉米粉、15份豆粕粉、20份秸秆粉、20份草炭土、35份磷尾矿、3份碳酸钙和43份蔗糖-硫酸铵营养液。更进一步地，培养基包括以下重量份计的原料：5份玉米粉、8份豆粕粉、25份秸秆粉、25份草炭土、40份磷尾矿、2份碳酸钙和48份蔗糖-硫酸铵营养液。一种上述弗氏链霉菌固体培养基的制备方法，包括以下步骤：(A)按照上述质量比例，称取玉米粉、豆粕粉、磷尾矿、秸秆粉、草炭土、碳酸钙，混合各原料得到混合物；(B)在上述混合物中加入营养液，机械搅拌混合均匀，自然pH，经灭菌处理，得到固体培养基。根据本专利技术优选的，所述灭菌处理条件为115-122℃下施加1.0-2.0kg/cm2压力20～40分钟。一种弗氏链霉菌孢子的固体发酵方法，包括以下步骤：1)孢子悬液制备：从冰箱菌种斜面挑取孢子接种茄瓶斜面，培养后加入无菌水洗脱制备孢子悬液；2)液体发酵：将孢子悬液接种到液体发酵培养基中进行液体发酵，至所述液体发酵培养基中菌丝体生长进入所述弗氏链霉菌的对数生长期，得到液体发酵种子液；3)固体发酵：将所述液体发酵种子液接种到以上述方法制备的弗氏链霉菌固体培养基中，进行固体发酵，得到固体发酵培养基。进一步地，所述孢子悬液的制备过程中，接种菌种为弗氏链霉菌，菌种保藏编号为CGMCC No.11963，于茄瓶斜面接种，28～32℃下恒温静置培养6～10天，用灭菌蒸馏水洗脱。进一步地，所述液体发酵过程中，发酵条件为温度28～32℃，震荡频率150～220r/分钟，恒温振荡培养24～36小时。更进一步地，所述液体发酵的条件为温度30～32℃，震荡频率180～200r/分钟。进一步地，所述液体发酵过程中，以上一步骤制备的孢子悬液作为接种菌液，接种量为液体发酵培养基体积的3-6％；所述液体发酵培养基的成分以重量比计算，包括2％的豆粕粉和0.5％的葡萄糖悬液，其余为水。进一步地，所述弗氏链霉菌固体培养基的发酵条件为在28～35℃下培养3～6天。更进一步地，所述弗氏链霉菌固体培养基的发酵条件为在30～34℃下培养4～5天。进一步地，所述弗氏链霉菌固体培养基的发酵过程包括发酵初期和产孢期；发酵初期固体培养基的水分含量为40～60％，进入产孢期后所述弗氏链霉菌固体培养基的水分含量小于35％；液体发酵种子液的接种量为所述弗氏链霉菌固体培养基质量的10～15％。发酵初期水分含量根据弗氏链霉菌固体培养基所含水分，液体发酵种子液以100％含水量计，补充液体发酵种子液至所需含水量；产孢期水分含量为将所得固体发酵培养基称重(W0)，彻底烘干后再次称重(Wt)，根据以下公式计算含水量：含水量＝(W0-Wt)/W0。根据本专利技术的另一方面还提供了一种农用弗氏链霉菌菌剂的制备方法，即在固体发酵结束后，将固体发酵产物孢子粉直接与褐煤以及磷尾矿粉复配得到弗氏链霉菌农用微生物菌剂粉剂产品。进一步地，所述农用弗氏链霉菌菌剂的制备过程中，固体发酵产物与褐煤以及磷尾矿粉的复配比例为20～40：30～60：60～80，以重量份计比；孢子粉与褐煤以及磷尾矿粉混合均匀后得到的弗氏链霉菌菌剂，使菌剂的水分含量为8～15％；所述弗氏链霉菌菌剂的水分含量以湿度计测定，置于恒温控制培养室调整菌剂水分含量。现有技术中常用的链霉菌固体发酵培养基组分存在以下问题：链霉菌固体发酵基质用到大量的玉米粉、麸皮，一般占总养分干重的40～80％。玉米粉、麸皮中含有丰富的纤维素、蛋白质、淀粉、维生素等，养分含量丰富，但在促进链霉菌生长繁殖的同时，容易滋生大量细菌，且细菌比链霉菌生长迅速，消耗掉大部分的养分，不利于链霉菌的孢子萌发和生长，致使产孢数量少，且生产的菌剂杂菌率严重超标。本专利技术选用少量玉米粉、豆粕粉以及秸秆粉代替玉米粉和麸皮作为固体培养基，一方面，秸秆粉为玉米秸秆收获籽实后的剩余部分磨成的粉状物，含有30％以上的碳水化合物、2％～4％的蛋白质和0.5％～1％的脂肪，与玉米粉、豆粕粉合理搭配后，可以为弗氏链霉菌提供充足的碳源、氮源，有利于其生长、产孢；另一方面，因玉米秸秆粉具有较强的吸水性、蓬松性，还具有减缓培养基质水分流失和提高固体培养基质透气性的效果。常用固体培养基组成中的细沙、细土虽然廉价、易得，但是需要严格控制沙、土的颗粒细度、以及理化指标，原料的前处理工序较多，且沙、土的养分含量较低，作为农用微生物菌剂施到土壤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种弗氏链霉菌固体培养基，其特征在于，以重量份计，包括：3～10份玉米粉、3～18份豆粕粉、18～45份秸秆粉、10～30份草炭土、20～50份磷尾矿、1～10份碳酸钙、40～50份营养液。

【技术特征摘要】
1.一种弗氏链霉菌固体培养基，其特征在于，以重量份计，包括：3～10份玉米粉、3～18份豆粕粉、18～45份秸秆粉、10～30份草炭土、20～50份磷尾矿、1～10份碳酸钙、40～50份营养液。2.根据权利要求1所述的弗氏链霉菌固体培养基，其特征在于，所述秸秆粉的粒径细度为30-50目；所述草炭土细度为40目；所述磷尾矿粉颗粒细度在80目以下；优选的，以重量份计，所述营养液包括1～10份的蔗糖、1～5份的硫酸铵、0.1～1份磷酸二氢钾、85～92份水。3.根据权利要求2所述的弗氏链霉菌固体培养基，其特征在于，培养基以重量份计，包括：5～10份的玉米粉、8～10份的豆粕粉、18～25份的秸秆粉、20～30份的草炭土、30～40份的磷尾矿、2～3份的碳酸钙和43～48份蔗糖-硫酸铵营养液。4.根据权利要求3所述的弗氏链霉菌固体培养基，其特征在于，培养基包括以下重量份计的原料：10份玉米粉、10份豆粕粉、18份秸秆粉、30份草炭土、30份磷尾矿、2份碳酸钙和45份蔗糖-硫酸铵营养液；或，培养基包括以下重量份计的原料：7份玉米粉、15份豆粕粉、20份秸秆粉、20份草炭土、35份磷尾矿、3份碳酸钙和43份蔗糖-硫酸铵营养液；或，培养基包括以下重量份计的原料：5份玉米粉、8份豆粕粉、25份秸秆粉、25份草炭土、40份磷尾矿、2份碳酸钙和48份蔗糖-硫酸铵营养液。5.一种如权利要求1-4任意一项权利要求所述弗氏链霉菌固体培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(A)称取玉米粉、豆粕粉、磷尾矿、秸秆粉、草炭土、碳酸钙，混合各原料得到混合物；(B)在上述混合物中加入营养液，机械搅拌混合均匀，自然pH，经灭菌处理，得到弗氏链霉菌固体培养基；优选的，所述灭菌处理条件为115-122℃下施加1.0-2.0kg/cm2压力20～40分钟。6.一种利用权利要求1-4任意一项权利要求所述弗氏链霉菌固体培养基进行弗氏链霉菌孢子的固体发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：1)孢子悬液制备：从菌种斜面挑取孢...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡兆平，李新柱，邢芳芳，高明夫，禚优优，
申请(专利权)人：金正大生态工程集团股份有限公司，菏泽金正大生态工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37