象草维管组织特异性启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种象草维管组织特异性启动子及其应用。该启动子选自如下任一序列：(a)含有如SEQ ID NO.1～9任一所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO.1～9任一所示序列互补的核苷酸序列；(b)凡是经过人工修饰的，与SEQ ID NO.1～9任一所示的核苷酸序列具有至少75％同源性的核苷酸序列。该启动子可应用于植物特定组织表达，从而为植物的转基因育种提供有效的手段和工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物生物
，具体涉及一种象草维管组织特异性启动子及其应用。
技术介绍
启动子是指能与RNA聚合酶作用并能起始转录的一段DNA序列，被称为调控基因表达的枢纽，它能够控制基因的表达水平、表达部位及表达方式。为了克服组成性启动子，如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV 35s promoter)、激动蛋白启动子(Actin promoter)和玉米泛素启动子(Ubiquitin promoter)，在植物体内持续、高效表达时，对植物造成生长发育造成的不利影响。组织特异性或诱导性启动子的研究和应用越来越受到科研工作者的重视，通过组织特异性或诱导性启动子，不仅能控制基因的精确表达，而且还能避免过量表达对转基因植株的负面影响。组织特异性启动子是在植物的绿色组织(叶片)、分生组织(茎尖、根尖、幼芽)、维管组织(韧皮部、木质部及块茎)、薄壁组织、花粉、种子、果实和胚乳等组织中特异表达的启动子。它能够驱动外源基因在特定时间、特定部位表达积累，增加区域表达量，往往表现出发育调节的特性。其中维管组织特异性启动子主要分为韧皮部特异性启动子和木质部特异性启动子。韧皮部在植物体内，是负责运输有机物质的主要部位，富含糖等，因此成为细菌、真菌、病毒等植物病源和刺吸式昆虫的侵害目标。韧皮部特异启动子可以为抗病虫作物的生物技术育种提供启动元件。木质部是运输水分、无机离子的主要部位，起到支撑植物的作用。木质部特异启动子在深入了解木材形成过程中的分子机制和材性改良的基因工程育种中有重要意义。象草是热带亚热带地区的优良饲草，适口性好，利用率高。而且还能代替煤炭石油发电，种植1公顷的象草燃料产生的能量可替代36桶石油。但是象草中，木质素含量过高，影响反刍动物，如牛的消化速率，从而不利于牲畜增重。木质素同时也是制浆造纸工业的限制因素，因为要将木质素去除之后，才能获得纯的纤维素和半纤维素进行造纸。因此，木质素的调控是牧草或能源草培育的方向之一。通过维管组织特异性启动子特异启动外源基因控制在维管中的表达具有重要的理论和实践意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种象草维管组织特异性启动子，该启动子可应用于植物特定组织表达，从而为植物的转基因育种提供有效的手段和工具。本专利技术的另一目的在于提供所述的启动子的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种象草维管组织特异性启动子，选自如下任一序列：(a)含有如SEQ ID NO.1～9任一所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO.1～9任一所示序列互补的核苷酸序列；(b)凡是经过人工修饰的，与SEQ ID NO.1～9任一所示的核苷酸序列具有至少75％同源性的核苷酸序列。所述的启动子从象草中克隆获得，或通过人工合成方法获得。所述的维管组织特异性表达启动子在植物维管组织特异性表达调控基因中的应用。所述的植物优选为烟草。所述的应用包括用所述的象草维管组织特异性启动子转化植物、并通过损伤和激素处理来鉴定该象草维管组织特异性启动子的调控机制，为该启动子的应用奠定了基础。一种表达载体，含有上述象草维管组织特异性启动子。所述的表达载体，是将上述象草维管组织特异性启动子替换双元表达载体pCAMBIA1305.1的CaMV35S启动子获得。一种转基因细胞，是将上述象草维管组织特异性启动子或上述表达载体转入宿主细胞获得。所述的宿主细胞为根癌农杆菌细胞。所述的根癌农杆菌细胞优选为EHA105细胞。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本专利技术提供一种从象草中克隆获得的维管组织特异性表达启动子，该启动子可应用于植物特定组织表达，并可以应用于调控植物基因表达中，从而为植物的转基因育种提供有效的手段和工具。该启动子主要能驱动基因在植株的成熟时期表达。其中，具有296bp启动子的片段的染色部位主要是初生木质部；随着片段长度的增加，染色部位向两端延展；由内向外，染色部位逐渐覆盖至维管形成层及韧皮部，自外向内染色效果蔓延至髓细胞中；具有1154bp启动子片段的GUS染色最深，且覆盖面积最广。2、本专利技术用构建好的植物表达载体转化烟草、并通过损伤和激素处理来鉴定该维管组织特异性启动子的调控机制，为该启动子的应用奠定了基础。附图说明图1为第一次hi-TAIL PCR的第1轮TAIL PCR和第2轮TAIL PCR扩增得到的产物检测结果图；其中，M表示DNA marker DL2000，1st表示引物Hi-CADR1-1与AC1的第1轮TAIL PCR扩增条带，2ed表示引物Hi-CADR1-2与AC1的第2轮TAIL PCR扩增条带。图2为第二次hi-TAIL PCR的第1轮TAIL PCR和第2轮TAIL PCR扩增得到的产物检测结果图；其中，M表示DNA marker DL2000，1st表示引物Hi-CADR2-1与AC1的第1轮TAIL PCR扩增条带，2ed表示引物Hi-CADR2-2与AC1的第2轮TAIL PCR扩增条带。图3为启动子缺失片段的克隆检测结果图；其中，M表示DNA marker DL5000；泳道1～9分别对应181～2054bp的启动子片段。图4为CAD P-181启动子转化烟草的GUS染色及PCR鉴定结果图；其中，CK+是含有181bp启动子片段的阳性质粒。图5为CAD P-296启动子转化烟草的GUS染色及PCR鉴定结果图；其中，CK+是含有296bp启动子片段的阳性质粒。图6为CAD P-645启动子转化烟草的GUS染色及PCR鉴定结果图；其中，CK+是含有645bp启动子片段的阳性质粒。图7为CAD P-758启动子转化烟草的GUS染色及PCR鉴定结果图；其中，CK+是含有758bp启动子片段的阳性质粒。图8为CAD P-936启动子转化烟草的GUS染色及PCR鉴定结果图；其中，CK+是含有936bp启动子片段的阳性质粒。图9为CAD P-1154启动子转化烟草的GUS染色及PCR鉴定结果图；其中，CK+是含有1154bp启动子片段的阳性质粒。图10为CAD P-1340启动子转化烟草的GUS染色及PCR鉴定结果图；其中，CK+是含有1340bp启动子片段的阳性质粒。图11为CAD P-1565启动子转化烟草的GUS染色及PCR鉴定结果图；其中，CK+是含有1565bp启动子片段的阳性质粒。图12为CAD P-2054启动子转化烟草的GUS染色及PCR鉴定结果图；其中，CK+是含有2054bp启动子片段的阳性质粒。图13为启动子不同缺失片段转化烟草的GUS酶活性测定结果图；其中，WT表示野生型；CAD P-181～CAD P-2054表示缺失片段表达载体。图14为转基因烟草组培苗茎的GUS组织化学染色结果图；其中，WT表示野生型；a～i分别代表转化自缺失片段载体CAD P-181、CAD P-296、CAD P-645、CAD P-758、CAD P-936、CAD P-1154、CAD P-1340、CAD P-1565和CAD P-2054的烟草茎；Ph表示韧皮部；Ca表示形成层；SX表示次生木质部；PX表示初生木质部；Pi表示髓；标尺为200μm。图15为启动子对损失及激素的响应效果图；其中，WT表示野生型；CK表示空白对照(无处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种象草维管组织特异性启动子，其特征在于：所述的启动子选自如下任一序列：(a)含有如SEQ ID NO.1～9任一所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO.1～9任一所示序列互补的核苷酸序列；(b)凡是经过人工修饰的，与SEQ ID NO.1～9任一所示的核苷酸序列具有至少75％同源性的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种象草维管组织特异性启动子，其特征在于：所述的启动子选自如下任一序列：(a)含有如SEQ ID NO.1～9任一所示的核苷酸序列，或具有与SEQ ID NO.1～9任一所示序列互补的核苷酸序列；(b)凡是经过人工修饰的，与SEQ ID NO.1～9任一所示的核苷酸序列具有至少75％同源性的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的象草维管组织特异性启动子，其特征在于：所述的启动子从象草中克隆获得，或通过人工合成方法获得。3.权利要求1或2所述的象草维管组织特异性启动子在植物维管组织特异性表达调控基因中的应用。4.根据权利要求3所述的象草维管组织特异性启动子在植物维管组织特异性表达调控基因中的应用，其特征在于：所述的植物为烟草。5.根据权利要求3所述的象草维管组织特异性启动子在植物维管组织特异性表达调...

【专利技术属性】
技术研发人员：解新明，钟天秀，唐然，陈曙，张向前，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44