一种定量检测CD79α的酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种定量检测CD79α的酶联免疫试剂盒。本发明专利技术所述的定量检测CD79α的酶联免疫试剂盒包括：包被联合捕获抗体的酶标板、封闭液、洗涤液、CD79α标准品溶液、底物显色液、终止液、抗CD79α单抗检测抗体、辣椒过氧化物酶标记的链亲和素；其中，所述联合捕获抗体包括由融合蛋白免疫实验动物所得的抗CD79α多克隆抗体与抗CD79α单克隆抗体。本发明专利技术所述的酶联免疫试剂盒操作简单，耗时少，灵敏度高，适合大量样品的快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种检测CD79α的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
CD79α属免疫球蛋白超家族(IgSF)成员。在B细胞淋巴瘤、大部分的急性B淋巴细胞白血病和骨髓瘤中阳性表达，作为CD20的一个辅助检测因子，广泛用于B细胞及其来源肿瘤的识别。CD79α表达的阳性部位在胞膜和胞浆。CD79α是B细胞的广谱标记物，从前B开始到成熟的浆细胞都可以标记。CD79α向B细胞末端分化调节过程中会与CD79β有部分免疫反应交叉。CD79α可用于B细胞淋巴瘤CD79α(+)、前B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)CD79α(+)和急性T细胞淋巴细胞白血病CD79α(-)的鉴别。临床上用于检测CD79α的方法主要是采用免疫组织化学，但这种方法实验过程操作较复杂，所需时间长，灵敏度低，不能进行定量分析，所用试剂对实验人员危害较大；所需仪器设备昂贵，技术水平要求较高，不利于临床快速检测。而且，采用免疫组织化学法需进行活检，收集样本费时费力。活检组织肿瘤切片要求熟练和细致的技术，做出非常好的切片很难，它要求厚薄均匀、切片完整；肿瘤细胞形态复杂，分化程度各异，对病理医生的经验和操作水平要求高。此外，CD79α蛋白在肿瘤细胞会分泌或破裂后渗透到循环系统中。因此，有必要开发新的定量检测CD79α的试剂盒。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种简便、快捷、实用、灵敏、高效的检测CD79α的酶联免疫试剂盒。本专利技术所述的一种定量检测CD79α的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包括：包被联合捕获抗体的酶标板、封闭液、洗涤液、CD79α标准品溶液、底物显色液、终止液、抗CD79α 单抗检测抗体、辣椒过氧化物酶标记的链亲和素；其中，所述联合捕获抗体包括由CD79α蛋白免疫实验动物所得的抗CD79α多克隆抗体与抗CD79α单克隆抗体。根据本专利技术所述的酶联免疫试剂盒的进一步特征，所述联合捕获抗体的包被浓度为每种抗体10-100ng/100ul，检测抗体的浓度为200ng/ml。根据本专利技术所述的酶联免疫试剂盒的进一步特征，所述抗CD79α单抗是用序列为SEQ IDNO:1的多肽制备。根据本专利技术所述的酶联免疫试剂盒的进一步特征，所述抗CD79α单抗是根据以下方法制备的：将纯化的序列为SEQ ID NO:1的多肽与KLH偶联后免疫SPF级Balb/c鼠，所得小鼠脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0融合后筛选得到3株杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞分泌所得抗体用ProteinG/A亲和柱进一步纯化，得到抗CD79α单抗。根据本专利技术所述的酶联免疫试剂盒的进一步特征，所述的封闭液为pH7.2磷酸盐缓冲液中加入0.01％吐温20，5％的脱脂奶粉和多糖，其中多糖的浓度范围在0.5至10mg/ml之间，多糖选自：蔗糖、甘露糖、乳糖、海藻糖的一种或两种以上的组合。所述的CD79α蛋白用0.1mM的Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)诱导CD79α所述的联合捕获抗体的浓度为每种抗体10-100ng/100ul，检测抗体的浓度为200ng/ml。所述的包被液为保证能够长期保存，于0.05M pH 9.6的碳酸盐缓冲液中添加了0.01％的硫柳汞作为防腐剂。所述抗CD79α单抗是用序列为SEQ ID NO:1的多肽制备。所述抗CD79α单抗是根据以下方法制备的：将纯化的序列为SEQ ID NO:1的多肽与KLH偶联后免疫SPF级Balb/c鼠，所得小鼠脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0融合后筛选得到3株杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞分泌所得抗体用ProteinG/A亲和柱进一步纯化，得到抗CD79α单抗。所述的封闭液为pH7.2磷酸盐缓冲液中加入0.01％吐温20、5％的脱脂奶粉和起支持保护作用的多糖，其中多糖的浓度范围在0.5至10mg/ml之间，多糖类型可为蔗糖，甘露糖、乳糖，海藻糖其中的一种或几种组合。所述试剂盒抗原标准品的含量在1.5至100mg/ml之间。本专利技术所述的定量检测CD79α的酶联免疫试剂盒，其有益效果在于：(1)本专利技术克服膜蛋白不适于作为ELISA试剂的缺陷，采用特殊的纯化方式获得可溶性膜蛋白，再采用膜蛋白免疫动物获得多克隆抗体作为本专利技术试剂盒的捕获抗体，使试剂在反应体系中更加稳定。(2)采用了联合捕获抗体，由融合蛋白免疫实验动物所得的抗CD79α多克隆抗体与抗CD79α单克隆抗体组成，由此增加抗原抗体的结合位点，增加试剂盒的灵敏度，背景值低。因为CD79α的膜蛋白特性及不易包被在固相载体中，所以必须增加检测的灵敏度，而加入.01％吐温20是为了减少非特异吸附，刚好与弥补了联合抗体可能产生的假阳性。(3)本专利技术所述的试剂盒克服了传统的免疫组化方法的种种缺陷，其本试剂盒可测定到低至15mg/L的CD79α水平，能够用于白血病等血液肿瘤疾病的检测和危险性预测。(4)普通抗原抗体反应ELISA体系采用5％脱脂奶粉与1％牛血清白蛋白等传统封闭液，对膜蛋白抗原抗体反应体系的封闭效果往往很难令人满意，而本专利技术所述的试剂盒是通过使用加了多糖和吐温-20的封闭液，对于包被蛋白具有一定的保护作用，减少了非特异性吸附，特别是对于CD79α这类膜蛋白的构象有一定的支持作用。附图说明图1是单独抗CD79α抗体包被的ELISA试剂盒与联合抗体包被的ELISA试剂盒的灵敏度对比。图2是在相同条件下采用不同封闭液的对比实验结果。具体实施方式为使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1：多克隆抗体的制备1.基因和蛋白序列的来源人CD79α基因序列可参见XM_002829281，来自NCBI。根据CD79α的基因序列，合成分别位于阅读框上游和下游的引物。上游引物：caccatggctgggg gtccaggagt cctcca 下游引物：ttctcgagtcacggcttc tccagctgga c人CD79α基因全长为681bp，编码226个氨基酸，其中N-端1至32位氨基酸为信号肽。蛋白序列来源：BAD97091，来自NCBI。用于制备单抗的多肽序列为CSRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEK(SEQ ID NO.1)。2.表达质粒的构建和高表达工程菌株的获得表达载体构建方法：通过PCR扩增得到目的人CD79α基因，用NdeI+XhoI双切酶PCR产物及pET28a质粒将两个片段用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切/PCR鉴定筛选出阳性克隆。大量扩增确证的pET28a/CD79α质粒，用NdeI+XhoI双切酶鉴定；pET28a/CD79α质粒经测序验证后，转化进入大肠杆菌DE3，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒酶切鉴定，小量制备质粒，通过双酶切/PCR鉴定筛选出阳性克隆，获得含有CD79α的重组质粒工程菌。3.CD79α蛋白的表达纯化用0.1mM的Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)诱导上述CD79α重组质粒工程菌DE3-pET28a，1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定量检测CD79α的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被联合捕获抗体的酶标板、封闭液、洗涤液、CD79α标准品溶液、底物显色液、终止液、抗CD79α单抗检测抗体、辣椒过氧化物酶标记的链亲和素；其中，所述联合捕获抗体包括由CD79α蛋白免疫实验动物所得的抗CD79α多克隆抗体与抗CD79α单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测CD79α的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被联合捕获抗体的酶标板、封闭液、洗涤液、CD79α标准品溶液、底物显色液、终止液、抗CD79α单抗检测抗体、辣椒过氧化物酶标记的链亲和素；其中，所述联合捕获抗体包括由CD79α蛋白免疫实验动物所得的抗CD79α多克隆抗体与抗CD79α单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述联合捕获抗体的包被浓度为每种抗体10-100ng/100ul，检测抗体的浓度为200ng/ml。3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述抗CD79α单抗是用序列为SEQ ID NO:1的多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗树红，黄若磐，
申请(专利权)人：广州瑞博奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44