本发明专利技术提供了一组具有胰蛋白酶抗性的抗菌肽及其制备办法。利用蛋白质定向改造技术，针对NZ2114序列中存在的六处胰蛋白酶活性位点进行有选择突变。设计氨基酸序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：33的胰蛋白酶抗性突变体并实现其在毕赤酵母中的重组表达。本发明专利技术首次实现NZ2114抗胰蛋白酶衍生物的设计，经测定部分突变体(尤其是双突变体和全部三突变体)胰蛋白酶降解率显著改善，为16.67％-25％。胰蛋白酶抗性抗菌肽对金黄色葡萄球菌ATCC25923，ATCC43300和ATCC6538具有显著抑菌活性，MIC介于0.25-16μg/ml。本发明专利技术所述方法获得的胰蛋白酶抗性抗菌肽可应用于抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质工程和基因工程领域，具体涉及系列抗菌肽定向改造和基因工程生产的方法。
技术介绍
菌丝霉素Plectasin是Mygind研究组利用从欧洲北部松林中分离出的腐生子囊类真菌Pseudoplectania nigrella构建cDNA文库，通过BLASTX和SSEARCHp序列相似性搜索程序，筛查到的具有高效抗G+菌活性抗菌肽。Plectasin基因编码含有95个氨基酸残基的多肽序列，其1～23是信号肽序列，24～55位为前导肽序列，56～95位为成熟肽(Plectasin)序列。Plectasin理论分子量为4407.9Da，具有六个组氨酸(His)和五个赖氨酸(Lys)，在不同pH环境中，由于组氨酸解离状态不同，Plectasin的净电荷数在+1到+3之间变化(Mygind等，Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus.Nature，2005，437(7061)：975-980)。Plectasin对革兰氏阳性细菌具有强烈杀伤作用。Mygind等研究了Plectasin对130余株不同来源肺炎链球菌的抑制作用，发现对于青霉素敏感或抗性菌株，最小杀菌浓度(MIC)均在0.1-8μg/ml之间，MIC50为1μg/ml。Gottlieb等(2008)研究Plectasin对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)杀菌能力，MIC值介于1和32μg/ml，MIC50为8μg/ml(Gottlieb等，Antimicrobial peptides effectively kill a broad spectrum of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus strains independently of origin，sub-type，or virulence factor expression.BMC Microbiol，2008，8(1)：205-214)。此外，Novozymes以Plectasin为母体，经易错PCR构建突变文库，从274个突变体中筛选到抗菌性能大幅提高的突变体NZ2114，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离菌株平均MIC仅为1μg/ml，并且对耐万古霉素肠球菌(VRSA)也具有很强的抑制作用，MIC值仅为2～4μg/ml。此外，杀菌动力学实验证明，Plectasin具有高效杀菌能力，5×MIC Plectasin在5h内能够杀灭99.9％供试病原菌。小鼠腹腔感染模型显示，10mg/kg Plectasin 5h内杀菌效率
相当于70mg/kg万古霉素，腹腔中病原菌数量减少3个数量级(相当于99.9％杀菌效率)。7天后对照组小鼠全部死亡，按10mg/kg Plectasin给药的小鼠存活率依给药频度不同介于80～100％。NZ2114在兔心内膜炎感染模型中的治疗效果也得到相似结论，10mg/kg NZ2114即可大于或等于15mg/kg万古霉素或12mg/kg达托霉素疗效，3天后相关脏器(肾脏，脾脏)中病原菌的数量减少99％以上(Xiong等，Efficacy of NZ2114，a novel plectasin-derived cationic antimicrobial peptide antibiotic，in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2011，55(11)：5325-5330)。在胃肠道主要消化酶中，plectasin和NZ2114对胃蛋白酶具有良好的稳定性，在胃蛋白酶中孵育4h几乎不产生降解。但是，其对胰蛋白酶非常敏感，与胰蛋白酶孵育后活性几乎全部丧失。分析表明，NZ2114序列中存在6处胰蛋白酶切割位点，分别为R14，K20，K23，K26，K32，K38，这些位点的存在严重影响NZ2114胰蛋白酶稳定性，制约其口服治疗和作为添加剂的使用效果。目前，未见有关于NZ2114胰蛋白酶稳定性改造的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用蛋白质定向设计与改造技术提高NZ2114胰蛋白酶抗性的方法。为实现本专利技术目的，本专利技术提供了一系列抗菌肽，氨基酸序列包含SEQ IDNo.1-SEQ IDNo.33中的任意一项。本专利技术还提供一系列抗菌肽基因，核苷酸序列包含SEQ IDNo.34-SEQ IDNo.66中的任意一项。此外，本专利技术包含系列重组表达载体，其特征在于，携带有编上述编码抗菌肽基因序列(SEQ IDNo.34-SEQ IDNo.66)中的任意一项。本专利技术还提供了含有上述表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母基因工程菌。本专利技术进一步提供了在重组毕赤酵母中表达抗菌肽(SEQ IDNo.1-SEQ IDNo.33)的方法，其特征在于，其是将上述的重组毕赤酵母发酵培养，分泌产生抗菌肽。本专利技术首次实现胰蛋白酶抗性抗菌肽NZ2114系列衍生物的定向改造并实
现其在毕赤酵母中的表达。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，本专利技术实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York：Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。以下实施例中使用的酶和试剂：限制性内切酶、pfuDNA聚合酶、T4DNA连接酶等分别购自Biolabs、Invitrogen和Promega公司。四种dNTP购自Promega公司。DNA和蛋白质分子量标准为Biolabs产品。其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。以下实施例中涉及的培养基和缓冲液配方：LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl 10g/L；固体LB培养基则加入2％的琼脂糖。低盐LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl 5g/L；固体低盐LB培养基则加入2％的琼脂粉。MH培养基：酪蛋白水解物17.5g/L，牛肉浸粉5g/L，淀粉1.5g/L。MHA培养基：固体MH培养基则加入2％的琼脂粉。YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，葡萄糖20g/L；固体YPD培养基则加入2％琼脂粉。YPDS培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，山梨醇182.2g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L。有关LB培养基、低盐LB、MH、YPD、YPDS等培养基的使用参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。20mM本文档来自技高网...
【技术保护点】
一系列抗菌肽，氨基酸序列包含SEQ ID No.1‑SEQ IDNo.33中的任意一项。
【技术特征摘要】
1.一系列抗菌肽，氨基酸序列包含SEQ ID No.1-SEQ IDNo.33中的任意一项。2.一系列抗菌肽基因，核苷酸序列包含SEQ ID No.34-SEQ ID No.66中的任意一项。3.一种重组表达载体，其特征在于，携带有编码权利要求2中所述编码抗菌肽基因序列(SEQ ID No.34-SEQ ID...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，毛若雨，滕达，王秀敏，郝娅，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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