驴的miRNA序列、制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种驴的miRNA序列、制备方法及其应用。该miRNA序列为SEQ ID NO：1所示的序列，本发明专利技术中的miRNA序列通过特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应mRNA的转录作用，从而影响ACADVL基因的表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种驴的miRNA序列、制备方法及其应用。
技术介绍
微小RNA(MicroRNAs，简称miRNA)是一组不编码蛋白质的短序列单链RNA，长约22nt。miRNA基因主要单个或成簇地位于基因组的非编码区内。目前人们已经发现的miRNA约为数千个，大部分功能未知。据目前的研究显示，miRNA通过不完全碱基互补的方式与mRNA相应的区域结合，从而抑制蛋白质的翻译；在某些植物中，其还可以降解mRNA。通常一个基因可以被多个miRNA所调节，同时一个miRNA也可以调节多个mRNA。miRNA表达具有高度的保守性、时序性和组织特异性。研究表明miRNA参与了几乎所有的生命活动，并起着重要作用，在动物中，包括：细胞发育、造血、脂肪代谢、器官生成、凋亡、细胞增殖与分化及肿瘤的发生。此外，在某些病毒中也发现有miRNA表达。在动物细胞中，转录形成的miRNA的前体首先折叠成茎环结构，然后在DCL1的作用下剪切形成成熟的miRNA。在不同的动物组织、器官和不同的发育时期，miRNA的表达谱是不同的，对miRNA表达谱的研究对miRNA生物功能的研究起到巨大的推动作用。尽管目前已经在生物体中发现了一些miRNA，然而这些miRNA仅占生物体存在的miRNA中相当少的一部分，并且研究人员对于这些miRNA的功能还了解很少。综上所述，本领域迫切需要提供一种新型miRNA，以研究miRNA对生物体的调节作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种驴的miRNA序列，这种miRNA能够特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应mRNA的转录作用，从而影响相应基因的表达。为解决上述技术问题，本专利技术的实施方式提供了一种驴的miRNA序列，该miRNA序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。本专利技术的实施方式还提供了一种制备上述驴miRNA序列的方法，该方法包含以下步骤：1)取驴各个部位的若干离体组织分别放入若干个容器中，并将温度调节至：-60～-100℃；形成若干个样品组织1；2)取步骤1中样品组织1，在液氮环境中研磨，放置于若干个容器中；并加入1～3ml的总RNA抽提试剂，混合均匀后，调节温度至30～40℃孵育5～15min；调节温度至2～6℃并离心分离5～15min，取上清液加氯仿混合均匀后静置，形成若干个样品组织2；3)调节步骤2中样品组织2的温度至2～6℃，离心分离10～20min，并加入异丙醇，放置15～20min；形成若干个样品组织3；4)调节步骤3中样品组织3的温度至2～6℃，离心分离5～15min后去除上清液并洗涤沉淀；形成若干个样品组织4；5)调步骤4中样品组织4的温度至2～6℃，离心分离1～5min，室温放置，并加入15～50ul无菌无酶水，混合均匀；形成若干个样品组织5；6)取适量的步骤5中样品组织5构建Micro RNA文库；并通过测序平台测序，将测序得到的序列进行转化、处理后，即得若干个待分析纯净序列数据；7)将步骤6中待分析纯净序列数据与若干个核苷酸序列数据库进行比对，去除重复序列和干扰片段；即得通过比对的miRNA序列；8)将步骤7中通过比对的miRNA序列与数据库中的miRNA 前体进行比对筛选；即得未通过比对的miRNA序列；9)将步骤8中未通过比对的miRNA序列与已知的驴基因组序列进行比对，筛选得到若干个miRNA序列；10)对步骤9中的miRNA序列进行靶基因预测；即得SEQ ID NO：1所示的序列。本专利技术的实施方式还提供了一种将驴的miRNA序列用于制备抑制目的基因表达的组合物。本专利技术实施方式相对于现有技术而言，通过特异性结合到mRNA的相应部位，影响相应mRNA的转录作用，从而影响ACADVL基因的表达。进一步地，步骤1中取驴的心、肝、脾、肺、肾、脑、骨髓以及肌肉的离体组织。进一步地，步骤2中调节温度至4℃，离心分离器的转速为：12000r/分钟，离心时间：10分钟。进一步地，步骤2中的总RNA抽提试剂为Trizol试剂，每加入1ml的Trizol试剂相应加入0.2ml的氯仿，涡旋混匀15秒静置。进一步地，步骤4中用75％乙醇进行洗涤沉淀，其中，每使用1ml Trizol试剂至少使用1ml 75％的乙醇。进一步地，步骤5中调节步骤4中样品组织4的温度至2～4℃，离心分离2～4min，室温放置2～3min。进一步地，步骤6中的各个样品组织5等量混合后RNA分子完整数大于7、浓度不小于100ng/ul、总量大于10ug。进一步地，步骤6中的测序平台为Hiseq 2000测序平台。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的各实 施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本专利技术各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。本专利技术的第一实施方式涉及一种驴的miRNA序列，该miRNA序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。在本实施方式中，制备该miRNA序列的详细步骤如下：1.样品采集我们采取了一头驴的8个组织样：心、肝、脾、肺、肾、脑、骨髓、肌肉。将所取的组织放入无核糖核酸酶(RNase)的Eppendorf管中，立即投入液氮中，带回实验室后转移保存在-80℃冰箱，用于提取Total RNA与后续分析。2.Total RNA的提取与质量评估1)在经过液氮预冷的研钵里加入100mg组织样品，同时加入少许液氮，并迅速将样品研磨成粉末，然后转移至1.5mL的离心管；2)加入1ml Trizol(一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA)并混匀做匀浆处理，为了让核酸蛋白质复合物彻底分离，室温孵育10min；3)4摄氏度12000r/分钟离心10分钟，取上清；4)每加入1ml Trizol相应加入0.2ml氯仿，涡旋混匀15秒，室温静置3分钟；5)调节温度至4摄氏度，离心，调节离心的转速：12000r/分钟，离心15分钟分层后，(由于RNA主要集中在水层，取上层无色水相)并转移到新管中；6)在水相中加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置15-20分钟；7)调节温度至4摄氏度，离心，调节离心的转速：12000r/分钟，离心10分钟，去除上清液；8)加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀，每使用1ml Trizol使用1ml75％乙醇；9)调节温度至4摄氏度，离心，调节离心的转速：12000r/分钟，离心3分钟，倒出液体，剩余少量液体，短暂离心，吸出液体。室温放置2-3分钟，加入15-50ul无菌无酶水，混匀，溶解RNA；10)用1％的琼脂糖凝胶电泳,检验总RNA的完整性。具体步骤如下：取5μL总RNA与上样缓冲液(Loading Buffer)充分混匀后用1％的琼脂糖凝胶电泳在140V恒压电泳进行检测，高压快速电泳，在较短的时间内(20分钟切断电源)使RNA电泳完毕，防止RNA降解，由此来检验总RNA的完整性。结果显示，28S和18S两条亮带比较清晰，5s条带非常模糊，说明提取的样品RNA降解率较低，完整性较好，质量也较好。利用紫外光分光光度仪分别本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种驴的miRNA序列，其特征在于，所述miRNA序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种驴的miRNA序列，其特征在于，所述miRNA序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。2.根据权利要求1所述的驴的miRNA序列的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：1)取驴各个部位的若干离体组织分别放入若干个容器中，并将温度调节至：-60～-100℃；形成若干个样品组织1；2)取步骤1中所述的样品组织1，在液氮环境中研磨，放置于若干个容器中；并加入1～3ml的总RNA抽提试剂，混合均匀后，调节温度至30～40℃孵育5～15min；调节温度至2～6℃并离心分离5～15min，取上清液加氯仿混合均匀后静置，形成若干个样品组织2；3)调节步骤2中所述的样品组织2的温度至2～6℃，离心分离10～20min，并加入异丙醇，放置15～20min；形成若干个样品组织3；4)调节步骤3中所述的样品组织3的温度至2～6℃，离心分离5～15min后去除上清液并洗涤沉淀；形成若干个样品组织4；5)调节步骤4中所述的样品组织4的温度至2～6℃，离心分离1～5min，室温放置，并加入15～50ul无菌无酶水，混合均匀；形成若干个样品组织5；6)取适量的步骤5中所述的若干个样品组织5等量混合后构建Micro RNA文库；并通过测序平台测序，将测序得到的序列进行转化、处理后，即得若干个待分析纯净序列数据；7)将步骤6中所述的待分析纯净序列数据与若干个核苷酸序列数据库进行比对，去除重复序列和干扰片段；即得通过比对的miRNA序列；8)将步骤7中所述的通过比对的miRNA序列与数据库中的miRNA前体进行比对筛选；即得未通过比对的miRNA序列；9)将步骤8中所述的未通过比对的miRNA序列与已...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵一萍，任秀娟，萨如拉，李蓓，白东义，乌尼尔夫，杨丽华，乌云达来，芒来，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15