秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的构建方法，属于生物技术领域。本发明专利技术采用RNAi的方法建立的秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型，通过秀丽隐杆线虫体内产生mev-1基因的干扰效应，可使秀丽隐杆线虫体内活性氧含量升高，可以模拟体内活性氧上升所致的氧化损伤而造成的体内代谢异常，可用于研究体内活性氧升高对机体各种生理生化代谢过程的影响。该动物模型稳定可重复，可作为秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型为研究相关体内活性氧水平失调疾病的科研工作者提供一种工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的构建方法，属于生物

技术介绍
当体内的活性氧水平失调，活性氧水平较高时，就会引起生物体氧化损伤，大量研究表明许多疾病如糖尿病、癌症、亨廷顿氏舞蹈症、阿兹海默症、帕金森综合症、躁郁症、精神分裂症、焦虑症、非酒精性脂肪肝炎、心血管疾病等病理过程都与活性氧导致的氧化损伤有关。目前，体内活性氧水平失调的动物模型多以小鼠为主，但小鼠模型存在周期长，成本高，工作量大的问题，并且难以实现高通量。因此，大家急需一种方便、快速、低成本、高通量的体内活性氧水平失调动物模型。上世纪70年代初，有研究者开始尝试使用秀丽隐杆线虫作为模式生物，开创了一个全新的科研领域。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是一种常见的模式生物，秀丽隐杆线虫成虫体长1mm左右，全身透明，发育过程中很容易在显微镜下对其细胞和组织进行跟踪观察。秀丽隐杆线虫mev-1基因编码线粒体呼吸链复合体II内膜蛋白的亚基细胞色素b大亚基(cytochrome b,cytb)。MEV-1蛋白是呼吸链电子传递和氧化磷酸化的关键蛋白。mev-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫因体内活性氧增加而使细胞代谢异常，最引人关注的表型就是早衰。因此如果能建立以mev-1基因RNAi后的秀丽隐杆线虫为模型，将极大方便科研人员研究相关体内活性氧水平失调疾病。本专利技术建立的是以体内活性氧水平失调的秀丽隐杆线虫为基础的动物模
型，该秀丽隐杆线虫模型可以模拟体内活性氧上升所致的氧化损伤而造成的体内代谢异常，可用于研究体内活性氧升高对机体各种生理生化代谢过程的影响，为研究相关体内活性氧水平失调疾病的科研工作者提供一种工具。
技术实现思路
本专利技术主要提供一种简单易行、成本低廉的构建秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的方法，可以升高动物模型体内活性氧水平，可以模拟体内活性氧上升所致的氧化损伤而造成的体内活性氧水平失调状态，可用于研究体内活性氧升高变化对机体各种生理生化代谢过程的影响，可作为体内活性氧水平失调动物模型用于体内活性氧水平失调病发病机制研究和开发相关疾病的药物。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供的一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的构建方法为：将秀丽隐杆线虫mev-1基因片段插入到质粒载体上，并将其转化到宿主细胞中，构建克隆菌，诱导转化后的克隆菌表达mev-1的dsRNA，给秀丽隐杆线虫饲喂克隆菌，即建立秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型。其中，所述mev-1基因片段是用PCR的方法从秀丽隐杆线虫基因组中扩增出来的。其中，所述质粒载体为质粒L4440(pPD129.36)，宿主细胞为大肠杆菌HT115(DE3)。其中，将mev-1基因片段插入到质粒L4440(pPD129.36)两个反向T7启动子之间的多克隆位点处构建重组质粒。其中，所述诱导转化后的克隆菌时所用的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷。另外，本专利技术还提供一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型在筛
选治疗体内活性氧水平失调药物中的应用，所述活性氧水平失调是由活性氧上升引起的。本专利技术还提供一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型在筛选治疗体内代谢异常药物中的应用，所述代谢异常是活性氧上升所致的氧化损伤造成的。本专利技术还提供一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型在研究体内活性氧升高对机体各种生理生化代谢过程的影响中的应用。其中，上述所用的秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型均是是采用本专利技术所述方法构建的。同以前的方法相比，本专利技术存在以下优势：本专利技术采用RNAi的方法建立了秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型，通过秀丽隐杆线虫体内产生mev-1基因的干扰效应，可使秀丽隐杆线虫体内总活性氧含量升高，可以模拟体内活性氧上升所致的氧化损伤而造成的体内代谢异常，可用于研究体内活性氧升高变化对机体各种生理生化代谢过程的影响。另外，该动物模型稳定可重复，可作为体内活性氧水平失调动物模型用于体内活性氧水平失调发病机制研究和筛选相关疾病的药物。附图说明图1为质粒L4440的图谱。图2为秀丽隐杆秀丽隐杆线虫mev-1基因RNAi后对应基因mRNA表达量的变化。图3为秀丽隐杆线虫mev-1基因RNAi后体内活性氧含量的变化。具体实施方式以下提供具体实施例以实现本专利技术所述的一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的构建方法，但不限于这些实施例。1.生物材料(1)秀丽隐杆秀丽隐杆线虫株系：秀丽隐杆秀丽隐杆线虫野生型N2，购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)。(2)大肠杆菌：E.coli HT115(DE3)，作为重组质粒的宿主细胞，Caenorhabditis Genetics Center(CGC)；E.coli OP50，作为秀丽隐杆秀丽隐杆线虫正常的食物，购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)。(3)质粒载体：L4440(pPD129.36)，RNAi质粒载体，购于Addgene。本实验已将其转化进E.coli HT115(DE3)菌株中。2.试剂(1)50×TAE Buffer：242g Tris碱，57mL乙酸，100mL 0.5mol/L的EDTA(pH 8.0)，用蒸馏水定容至1000mL，使用时根据要求用蒸馏水进行稀释。(2)1％琼脂糖粉：将1g琼脂糖粉溶于100mL 1×TAE Buffer中，用微波炉加热，使琼脂糖粉完全溶解，室温冷却至60℃左右时加入适量溴化乙锭(EB)，充分混匀后倒入胶槽，插入合适的梳子，待凝胶完全凝固后拔去梳子即可使用。(3)盐酸四环素(Tetracycline Hydrochloride，Tet)：水溶，过滤除菌，母液浓度为25mg/mL，-20℃避光保存(生工生物工程(上海)股份有限公司)。(4)氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)：水溶，过滤除菌，母液浓度为100mg/mL，-20℃避光保存(生工生物工程(上海)股份有限公司)。(5)CaCl2：水溶，高温高压(121℃，20min)灭菌，储存浓度为1mol/L，
4℃保存。(6)限制性内切酶：BglII、XhoI、HindIII(购自TaKaRa公司)(7)T4连接酶(购自TaKaRa)(8)DL-2000 DNA maker和DL-10000 DNA maker(购自TaKaRa)(9)6×Loading Buffer(购自TaKaRa)(10)胆固醇(Cholesterol)：醇溶，过滤除菌，储存浓度为5mg/mL，4℃避光保存(天津市光复精细化工研究所)。(11)MgSO4：水溶，高温高压(121℃，20min)灭菌，储存浓度为1mol/L，室温保存。(12)S基础液：NaCl 0.585g，K2HPO4 0.1g，KH2PO4 0.6g，用蒸馏水定容至100mL。(13)半饱和KCl溶液：向适量体积的蒸馏水中加入过量KCl，充分搅拌，使溶液达到饱和状态，过滤上清，将滤液与蒸馏水按照1:1(v:v)的比例混匀，即为半饱和KCl溶液。(14)连二亚硫酸钠：保险粉，分子式：NaO2SSO2Na。(15)4％Na2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的构建方法，将秀丽隐杆线虫mev‑1基因片段插入到质粒载体上，并将其转化到宿主细胞中，构建克隆菌，诱导转化后的克隆菌表达mev‑1的dsRNA，给秀丽隐杆线虫饲喂克隆菌，即建立秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型。

【技术特征摘要】
1.一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的构建方法，将秀丽隐杆线虫mev-1基因片段插入到质粒载体上，并将其转化到宿主细胞中，构建克隆菌，诱导转化后的克隆菌表达mev-1的dsRNA，给秀丽隐杆线虫饲喂克隆菌，即建立秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型。2.根据权利要求1所述的一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的构建方法，其特征在于，所述mev-1基因片段是用PCR的方法从秀丽隐杆线虫基因组中扩增出来的。3.根据权利要求1所述的一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的构建方法，其特征在于，质粒载体为质粒L4440，宿主细胞为大肠杆菌HT115(DE3)。4.根据权利要求3所述的一种秀丽隐杆线虫体内活性氧水平失调动物模型的构建方法，其特征在于，将mev-1基因片段插入到质粒L4440两个反向T7启动子之间的多克隆位点处构建重组质粒。5.根据权利要求1所述的一种秀...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红玉，田静，冯娜，支德娟，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62