特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种EphA2来源的抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其氨基酸序列为Gln‑Asn‑Ile‑Met‑Asn‑Asp‑Met‑Pro‑Ile。本发明专利技术还包括上述肽在制备肿瘤治疗性DC‑CIK中的应用。本发明专利技术所制备的特异性的DC‑CIK细胞对肝癌细胞HepG2显示出一定的杀伤率，可用于制备肝癌特异性自体免疫细胞的制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及表位肽
，尤其涉及一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽及其应用，还涉及一种肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞的制备方法及其应用，以及一种肿瘤抗原EphA2特异性DC-CIK细胞的制备方法及其应用。
技术介绍
Eph(erythropoietin producing human hepatocellularcarcinoma)受体家族是受体酪氨酸激酶(RTKs)家族成员中最大的亚族，Eph受体和其配体ephrins间的相互作用参与了胚胎发育的许多过程，如在神经轴突导向﹑血管发生﹑肿瘤形成等方面具有重要作用。EphA2是EphA亚家族受体8个成员中的第2个，与Eph受体家族的其他成员有着相似的结构特征，并且与细胞增殖﹑迁移等有关。EphA2在正常成熟细胞尤其是上皮细胞中处于低表达状态，而在一些恶性肿瘤中广泛高表达，如肝癌、食管癌、前列腺癌、侵袭性黑色素瘤、神经胶质瘤、卵巢癌等等。目前治疗癌症主要有外科疗法(手术)、化学疗法(化疗)、放射治疗(放疗)和生物治疗四大模式，外加传统的中医药治疗和现代微创治疗方法。但是大多数病人的经过治疗后的生存率和生活质量均没有得到很大改善。这可能由于肿瘤在发生的早期就有部分肿瘤细胞转移到其他组织或器官，而目前的检查手段并不能显示出来，这很可能是很多肿瘤在治疗后，出现复发和转移的主要原因。因此肿瘤的治疗需要作为全身性疾病进行治疗，不仅要去除局部病灶的肿瘤，还要防止肿瘤的复发、转移。才可能真正有效地提高肿瘤病人的治愈率和生存期。传统的化疗药物虽然在某些肿瘤的治疗方面取得一定的进展，但是患者的5年生存率来看，并没有明显改善，同时化疗药物容易出现获得性多耐药及毒副作用，限制其临床使用，因此需要更好的全身治疗的手段。免疫细胞治疗是近二十年发展起来的，指的是刺激人体自身免疫系统来抵抗癌症的治疗方法。肿瘤免疫治疗有望成为继手术、化疗、放疗、靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。相比于传统的治疗方法表现出更好的靶向性和特异性，对肿瘤的治疗更为有效，无毒副作用，对提高生命质量、延长生存期有显著地效果，是目前肿瘤全身治疗的最佳手段之一。然而，目前在诱导特异DC-CIK细胞的抗原仍有待改进，缺乏能够高效刺激肿瘤特异性DC-CIK的CTL表位多肽抗原。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术目的在于提供一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽。本专利技术目的还在于提供上述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽的应用。本专利技术目的还在于提供一种肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞的制备方法。本专利技术目的还在于提供一种肿瘤抗原EphA2特异性DC-CIK细胞的制备方法。本专利技术目的还在于提供上述肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞和DC-CIK细胞的应用。为实现上述目的，本专利技术采取如下技术方案：本专利技术提出的一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽，所述CTL识别表位肽为九肽，其氨基酸序列如下：Gln-Asn-Ile-Met-Asn-Asp-Met-Pro-Ile。上述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽采用固相合成法进行合成。基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将第二个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的肽，再经HPLC纯化，其纯度大于90％。本专利技术还提出的上述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽在制备具有EphA2表达的肿瘤治疗性多肽疫苗的应用。优选地，上述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽在制备肝癌EphA2表达相关的肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用，尤其对肝癌细胞HepG2具有杀伤力。本专利技术还提出的一种肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞的制备方法，采用上述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽加入DC细胞进行培养得到。本专利技术还提出的上述肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞的制备方法得到的特异性DC细胞在制备治疗EphA2表达相关的肿瘤药物中的应用。本专利技术还提出的一种肿瘤抗原EphA2特异性DC-CIK细胞的制备方法，采用上述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽进行诱导得到。本专利技术还提出的上述肿瘤抗原EphA2特异性DC-CIK细胞的制备方法得到的特异性DC-CIK细胞在制备治疗EphA2表达相关的肿瘤药物中的应用。本专利技术巧妙利用EphA2在肝癌等肿瘤中呈现高表达，而在正常组织中表达很低，从而采用理论和实验相结合的方法筛选得到肿瘤相关抗原的表位肽，所得表位肽未见文献报道，为研制基于抗原EphA2的肿瘤疫苗或肿瘤特异性CTL细胞的制备提供理论基础，并为后续多价的抗原肽疫苗构建奠定基础。附图说明图1为本专利技术提出的一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽的质谱分析图。图2为本专利技术实施例1所得P1、P2、P3……P20各自诱导得到的特异性CTL细胞分泌INF-γ的能力对比图。图3为本专利技术实施例1所得P5、P8、P11、P13各自诱导得到的特异性CTL细胞对肝癌细胞HepG2杀伤能力对比图。图4为由本专利技术提出的一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽所制备得到的特异性CTL细胞免疫细胞群的流式细胞仪检测数据的统计分析图。具体实施方式下面，通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。实施例1：合成表位肽采用理论与实践相结合的方法，根据抗原的一级结构，综合运用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、WAPP和EpiJen综合对EphA2的抗原CTL表位进行预测分析，选取评分前20的多肽序列进行试验筛选，一次命名为P1、P2、P3……P20。基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将第二个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的表位肽粗品。将目的表位肽粗品经HPLC纯化得到目的表位肽精肽，其纯度大于90％，质谱分析证实其分子量符合理论值。本专利技术提出的一种特异性肿瘤抗原EPHA2的CTL识别表位肽采用Fmoc固相合成法进行合成，所述CTL识别表位肽为九肽，编号为P8，其氨基酸序列如下：Gln-Asn-Ile-Met-Asn-Asp-Met-Pro-Ile。对P8进行质谱分析，其质谱分析结果如图1所示，可以证实其分子量为1075.25976g/mol，符合理论值。实施例2：多肽功能检测上述所得P8和其余19个表位肽，可用于制备具有EphA2表达的肿瘤治疗性多肽疫苗，其应用实验如下：1、上述CTL识别表位肽诱导特异性CTL细胞、IFN-γ分泌及对肿瘤靶细胞的杀伤实验检测：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽，其特征在于，所述CTL识别表位肽为九肽，其氨基酸序列为Gln‑Asn‑Ile‑Met‑Asn‑Asp‑Met‑Pro‑Ile。

【技术特征摘要】
1.一种特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽，其特征在于，所述CTL识别表位肽为九肽，其氨基酸序列为Gln-Asn-Ile-Met-Asn-Asp-Met-Pro-Ile。2.权利要求1所述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽在制备具有EphA2表达的肿瘤治疗性多肽疫苗的应用。3.权利要求1所述特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽在制备肝癌EphA2表达相关的肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。4.一种肿瘤抗原EphA2特异性DC细胞的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1所述特...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐奇，冯振卿，许国贞，刘振云，蒯兴旺，朱进，章明炯，
申请(专利权)人：安徽未名细胞治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34