本发明专利技术公开了一种青蒿AabZIP9基因编码序列的克隆及其应用。具体包括基因AabZIP9的克隆、含有该基因的植物表达载体的构建、该基因对青蒿素生物合成途径特有基因启动子的激活作用。上述青蒿AabZIP9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还公开了AabZIP9基因具有能够激活青蒿素生物合成途径特异基因ADS和ALDH1表达的特性。本发明专利技术中AabZIP9基因可应用于青蒿品质改良，可提高青蒿中青蒿素的含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种青蒿bZIP类转录因子编码序列AabZIP9及其克隆方法与应用。
技术介绍
植物中新陈代谢分为初生代谢和次生代谢，初生代谢产物(如糖类、脂类和核酸)存在于所有的植物中，是植物维持细胞生命活动所必需的，而植物次生代谢产物是指植物中一大类非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其合成与分布具有种属、组织器官和生产发育特异性。例如，治疗疟疾的特效药物成分青蒿素只在植物青蒿(Artemisia annua L.)植株表面的分泌型腺毛中合成并储存。近年来，随着对中草药成分研究的逐步深入，发现许多中草药的有效成分均为植物次生代谢产物，例如丹参中的丹参酮，长春花中的长春生物碱等。大部分植物次生代谢产物其在天然植物中的含量极低，而使用化学合成的方法，工艺流程复杂、成本太高，并且还有许多植物次生代谢产物的生物合成途径不清晰，无法实现化学全合成。因此，研究人员开始探索其他的提高植物次生代谢产物含量的方法。考虑到植物次生代谢产物合成途径复杂，参与反应的基因数量多，且受到发育，环境等多种因素的影响，对途径上单个基因进行修饰有时难以奏效。而转录因子通常可以调控某个植物次生代谢产物生物合成途径上的多个酶基因的表达，从而调控该次生代谢产物的生物合成量。目前，在青蒿中已有报道发现，转录因子可以有效调控青蒿素合成途径特有基因的表达，从而调控青蒿素的生物合成，例如AaORA1转录因子，AabZIP1转录因子，AaMYC2转录因子等等。因此，克隆能调控青蒿素生物合成途径特有基因表达的转录因子，对于改良并提高青蒿中青蒿素的含量具有重要的意义。专利技术内容本专利技术的目的在于提供一种青蒿AabZIP9基因及获得其核苷酸序列的方法，还提供了该基因的蛋白编码序列，并且提供了该基因生物学功能快速确定的方法。该基因编码一个bZIP类转录因子，对其部分生物学功能进行了确定。将含有目的AabZIP9基因的农杆菌和含有青蒿素生物合成途径特异基因启动子的报告载体的农杆菌，通过烟草注射侵染瞬时表达的方法，经双荧光素报告分析发现，该基因能够激活青蒿素生物合成途径特异基因启动子的表达，为青蒿素代谢工程改良提供了有效的候选基因。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种青蒿bZIP类转录因子编码序列，该编码序列记为AabZIP9，AabZIP9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术还提供了一种青蒿bZIP类转录因子编码序列，AabZIP9编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术还提供了一种多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本专利技术还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。其构建方法包括以下步骤：步骤1、根据SEQ ID NO.1序列设计扩增AabZIP9基因开放阅读框序列，扩增引物如下：正向引物P3：5’-CACCATGGCCGCAAACCCTGTCTGG-3’反向引物P4：5’-AACGTTACGATGAGAATCCAAAGG-3’；步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接pENTR-TOPO载体；步骤3、将连接入AabZIP9基因的pENTR-TOPO载体与pEearlygate104植物表达载体通过LR反应的方式构建含有目的基因的pEearlygate104-AabZIP9植物表达载体。本专利技术还提供了一种重组表达转化体，该重组表达转化体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。进一步地，上述重组表达转化体的宿主菌株为农杆菌。本专利技术还提供了上述青蒿bZIP类转录因子编码序列AabZIP9在提高青蒿素含量中的应用。本专利技术还提供了上述青蒿bZIP类转录因子编码序列AabZIP9的克隆方法，该克隆方法包括以下步骤：步骤1、总RNA的提取与纯化，采用各种通用的植物总RNA提取试剂盒提取并纯化获得青蒿叶片总RNA；步骤2、用反转录酶将青蒿叶片总RNA反转成cDNA；步骤3、以上述cDNA为模板，通过设计基因特异引物，采用PCR的方法扩增，获得PCR产物，基因特异引物为：正向引物P1：5’-TTTCAAACTGTGGTGGAATGGC-3’反向引物P2：5’-CAATAAGAGGCTTAGGAGAGGG-3；步骤4、PCR产物回收纯化测序，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种快速检测AabZIP9编码的氨基酸序列的生物学功能的方法，该方法包括以下步骤：步骤1、根据SEQ ID NO.1序列设计扩增AabZIP9基因开放阅读框序列，扩增引物如下：正向引物P3：5’-CACCATGGCCGCAAACCCTGTCTGG-3’反向引物P4：5’-AACGTTACGATGAGAATCCAAAGG-3’；步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接pENTR-TOPO载体；步骤3、将连接入AabZIP9基因的pENTR-TOPO载体与pEearlygate104植物表达载体通过LR反应的方式构建含有目的基因的pEearlygate104-AabZIP9植物表达载体；步骤4、将青蒿中青蒿素合成途径特有ADS基因的启动子ProADS连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProADS；步骤5、将青蒿中青蒿素合成途径特有CYP71AV1基因的启动子ProCYP71AV1连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AV1；步骤6、将青蒿中青蒿素合成途径特有DBR2基因的启动子ProDBR2连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2；步骤7、将青蒿中青蒿素合成途径特有ALDH1基因的启动子ProALDH1连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProALDH1；步骤8、将pEearlygate104-AabZIP9植物表达载体和植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AV1、pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDH1分别转化入农杆菌中，获得包含目的载体的农杆菌工程菌株；步骤9、将包含pEearlygate104-AabZIP9植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合后，通过注射侵染的方式注射到生长5周的烟草叶片中；步骤10、取注射后培养2天的烟草叶片，用液氮速冻后研磨成粉末；步骤11、采用Promega-Dual-Luciferase检测试剂盒检测荧光强度，确定AabZIP9基因与青蒿素合成途径特有基因启动子的激活作用。进一步地，上述步骤8中，宿主菌为农杆菌GV3101菌株；上述步骤9中，包含pEearlygate104-AabZIP9植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种青蒿bZIP类转录因子编码序列，其特征在于，所述编码序列记为AabZIP9，所述AabZIP9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种青蒿bZIP类转录因子编码序列，其特征在于，所述编码序列记为AabZIP9，所述AabZIP9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种青蒿bZIP类转录因子编码序列，其特征在于，所述AabZIP9编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。5.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。6.根据权利要求1或2所述的青蒿bZIP类转录因子编码序列AabZIP9在提高青蒿素含量中的应用。7.根据权利要求1所述的青蒿bZIP类转录因子编码序列AabZIP9的克隆方法，其特征在于，所述克隆方法包括以下步骤：步骤1、总RNA的提取与纯化，采用各种通用的植物总RNA提取试剂盒提取并纯化获得青蒿叶片总RNA；步骤2、用反转录酶将所述青蒿叶片总RNA反转成cDNA；步骤3、以所述cDNA为模板，通过设计基因特异引物，采用PCR的方法扩增，获得PCR产物，所述基因特异引物为：正向引物P1：5’-TTTCAAACTGTGGTGGAATGGC-3’反向引物P2：5’-CAATAAGAGGCTTAGGAGAGGG-3；步骤4、PCR产物回收纯化测序，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。8.根据权利要求4所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：步骤1、根据SEQ ID NO.1序列设计扩增AabZIP9基因开放阅读框序列，扩增引物如下：正向引物P3：5’-CACCATGGCCGCAAACCCTGTCTGG-3’反向引物P4：5’-AACGTTACGATGAGAATCCAAAGG-3’；步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接pENTR-TOPO载体；步骤3、将连接入AabZIP9基因的pENTR-TOPO载体与pEearlygate104植物表达载体通过LR反应的方式构建含有目的基因的pEearlygate104-AabZIP9植物表达载体。9.一种快速检测根据权利要求2所述的AabZIP9编码的氨基酸序列的生物学功能的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、根据SEQ ID NO.1序列设计扩增AabZIP9基因开放阅读框序列，扩增引物如下...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，沈乾，黄华仪，颜廷祥，陈明慧，何倩，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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