一种基于NIR光谱技术的灵芝多糖定量方法技术

本发明专利技术公开了一种基于NIR光谱技术的灵芝多糖定量方法，制备灵芝菌丝体干粉；对灵芝菌丝体干粉建立校正集和验证集；对于校正集的灵芝菌丝体干粉，利用硫酸蒽酮法进行多糖测定；对校正集和验证集的灵芝菌丝体干粉进行NIR检测；进行矢量归一化后，选定一阶导数作为建模预处理方式；利用校正集的硫酸蒽酮法测量结果和测量光谱构建定量模型，选择波数范围为4900～4667cm‑1和4553～4000cm‑1，将验证集的测量的光谱导入上述多糖分析模型，对照利用硫酸蒽酮法测定的结果，利用所构建的模型进行结果预测。本发明专利技术利用NIR光谱技术，结合硫酸蒽酮法测定的结果，对液体发酵的灵芝菌丝体多糖含量构建数学模型，以便建立基于NIR光谱技术的灵芝菌丝体发酵多糖定量方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种农业发酵技术，尤其涉及的是一种基于NIR光谱技术的灵芝多糖定量方法。
技术介绍
灵芝(Ganoderma Lucidum)为担子菌亚门、层菌纲、多孔菌目、非褶菌科、灵芝属的子实体，为比较名贵的传统中草药。其中，灵芝多糖对肿瘤、免疫性疾病、高血糖、细胞衰老有治疗能力。灵芝中分离出来的灵芝三萜类物质及其衍生物有80多种，现代药理研究表明，灵芝三萜类化合物具有保肝、抗肿瘤、抗氧化、抑制血管紧张素、抗HIV病毒活性等作用。灵芝多糖具有抗肿瘤，调节免疫，保肝，调节血糖等作用。灵芝多糖因其具有的药用功能，一直受到广泛关注。其中常用的灵芝多糖生产方法为发酵法。通过发酵获得大量的灵芝菌丝体，从中提取获得灵芝多糖。对灵芝多糖测定的常用方法为分光光度法，如硫酸蒽酮法和硫酸苯酚法。但无论上述哪种方法都涉及大量化学试剂的使用，易造成环境污染；实验操作相对复杂；只能对单一成分进行检测。无法实现快速、多成分、无污染的实时检测。相比之下，NIR光谱法检测具有多方面的优势，适于灵芝多糖的快速定量分析。近红外光是指波长在780～2526nm的电磁波。应用近红外(Near Infrared，NIR)光谱可以反映生物分子中C-H、O-H、N-H和S-H等基团的信息。因而在农业、林业、食品产业和制药工业等方面都有相关的应用研究。例如，在农业方面，NIR光谱技术应用范围比较广泛，如稻谷、玉米、大豆等谷物的蛋白质含量、水分含量等都已在中国、德国、英国、法国建立了相应的国家标准和国际标准，动物饲料中的水分、粗蛋白、粗纤维、赖氨酸、蛋氨酸等也在中国和德国建立了国家标准和国际标准；食品行业中，英国也建立了乳制品的国家标准；中国木材加工业也建立了基于NIR光谱技术的定性分析国家标准；轻工业方面也建立了纸张的定量标准。可见，随着近红外光谱仪的技术进步、化学计量学方法的完善和计算机计算能力的提高，基于NIR光谱技术的定性和定量分析方法日趋成熟。且由于NIR光谱技术具有重复性好、检测速度快、无污染、可对多组分同时分析、可实时在线检测等优点，受到越来越广泛的关注。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于NIR光谱技术的灵芝多糖定量方法，实现对液体发酵的灵芝菌丝体多糖的定量分析。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术包括以下步骤：(1)利用发酵方式获得灵芝菌丝体，并制备灵芝菌丝体干粉；(2)对于灵芝菌丝体干粉，利用硫酸蒽酮法进行多糖测定；(3)并对灵芝菌丝体干粉进行NIR检测，波数范围为12500～4000cm-1，并收集光谱数据；(4)将测量光谱在12500～9000cm-1范围内截除，保留9000～4000cm-1光谱范围，进行矢量归一化后，选定一阶导数作为建模预处理方式；(5)建立校正集和验证集，利用校正集的硫酸蒽酮法测量结果和测量光谱构建定量模型，对灵芝多糖进行提取和纯化，并对灵芝浸提沉淀、灵芝浸提后上清液、灵芝上清液浓缩后粗多糖、醇沉复溶后的灵芝多糖粗提液、除蛋白后的灵芝多糖粗提液和透析后的灵芝多糖粗提液六种冻干样品分别进行NIR测定，根据光谱谱线收敛情况选择波数范围为4900～4667cm-1和4553～4000cm-1，建立基于偏最小二乘的多糖分析模型；(6)将验证集的测量的光谱导入上述多糖分析模型，对照利用硫酸蒽酮法测定的结果，利用所构建的模型进行结果预测。利用校正集的硫酸蒽酮法测量结果和测量光谱构建定量模型，构建模型基于两方面考虑：一是根据实验中得出的结论，即通过对灵芝样品进行一定的处理，使得不同的灵芝样品中含有不同含量的蛋白质、脂类、糖类等成分，对这些样品进行NIR检测，测量和分析其NIR光谱图，从中可以找到与灵芝多糖组分密切相关的光谱谱段，使得所选谱段既包含灵芝多糖区域又不宜太宽而引入其它成分的影响；二是定量模型本身，通过调整选取的光谱谱段，使得PLS定量计算中R2值和RPD值尽可能大，RMSEC尽可能小，以使该定量模型比较准确。在此基础上，选择波数范围为4900～4667cm-1和4553～4000cm-1，建立基于偏最小二乘的多糖分析模型。所述步骤(1)中，制备灵芝菌丝体干粉的具体过程如下：将灵芝菌种取0.5cm2小块，接种于灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃，180rpm摇床发酵培养，至菌丝体长满培养液，将菌丝体取出，4000rpm离心5min，弃上清，保留沉淀，即菌丝体，用无菌ddH2O清洗菌丝体，并离心2次，将菌丝体置于60℃下干燥，干燥后用研钵研磨成均匀干粉末，备用。利用发酵方式获得灵芝菌丝体提取灵芝多糖的具体过程如下：取样品粉末2g，置于烧瓶中，加水60ml，80℃水浴加热1h，加热提取3h，5000rpm离心8min，保留上清，沉淀搅开，加水60ml，80℃水浴加热2小时，5000rpm离心8min，合并上清，置于水浴上蒸干，残渣加5ml ddH2O溶解，边搅拌边缓慢滴加无水乙醇75ml，摇匀，4℃放置12h，离心，弃去上清，沉淀加热水溶解后定容于50ml，待测。所述步骤(2)中，利用硫酸蒽酮法测定灵芝发酵菌丝中多糖含量具体过程如下：首先绘制葡萄糖标准曲线；然后进行样品测定，取待测样品2ml，置于10ml具塞试管中，迅速加入0.25％的硫酸蒽酮溶液6ml，摇匀后放置15分钟，冰浴冷却15分钟，取出，以相应的试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，按照上述绘制的标准曲线，计算样品中以葡萄糖计的所含多糖含量。所述葡萄糖的标准曲线绘制：对葡萄糖在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线并按照标准曲线计算样品中的多糖含量。所述步骤(3)中，采集样品的近红外漫反射光谱，波数范围为12500～400cm-1，分辨率16cm-1，扫描次数32次，利用积分球聚集光信号，InGaAs检测器检测，每份样品采集至少2次光谱，取其平均光谱作为样品原始光谱。所述步骤(3)中，还包括对数据的分析：将测量结果进行聚类分析。采用聚类分析，以便评价样本FTIR光谱的相似性、样品特征性的光谱子集。比较多种预处理方法对建模结果的影响。包括多元散射校正(MSC)、一阶导数、二阶导数等。最终选定一阶导数作为建模预处理方式。一阶导数法可有效的消除基线和其他背景的干扰，分辨重叠峰，提高分辨率和灵敏度，有利于在复杂的峰形中更好的确定谱峰的准确位置，从而达到鉴别光谱的目的。所述步骤(5)中，按照1：1的数量比划分校正集和验证集。所述步骤(5)中，所述多糖分析模型中R2值为0.9793，RMSECV为0.0751，RPD为6.95，维数为8。所述步骤(6)中，所述模型进行预测时，具体参数为：RMSEP为0.918，RPD为2.66，Bias为0.853，相关因子为0.942。利用校正集的硫酸蒽酮法测量结果和测量光谱构建定量模型，所构建模型基于两方面考虑：一是根据实验中得出的结论，即通过对灵芝样品通过一定的步骤进行处理，使得不同样品中所含有不同含量的蛋白质、脂类、糖类等成分，对这些样品进行NIR检测，测量和分析其NIR光谱图，从中可以找到与灵芝多糖组分密切相关的光谱谱段，使得所选谱段既包含灵芝多糖区域又不宜太宽而引入其它成分的影响；二是定量模型本身，通过调整选取的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于NIR光谱技术的灵芝多糖定量方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用发酵方式获得灵芝菌丝体，并制备灵芝菌丝体干粉；(2)对于灵芝菌丝体干粉，利用硫酸蒽酮法进行多糖测定；(3)并对灵芝菌丝体干粉进行NIR检测，波数范围为12500～4000cm‑1，并收集光谱数据；(4)将测量光谱在12500～9000cm‑1范围内截除，保留9000～4000cm‑1光谱范围，进行矢量归一化后，选定一阶导数作为建模预处理方式；(5)建立校正集和验证集，利用校正集的硫酸蒽酮法测量结果和测量光谱构建定量模型，对灵芝多糖进行提取和纯化，并对灵芝浸提沉淀、灵芝浸提后上清液、灵芝上清液浓缩后粗多糖、醇沉复溶后的灵芝多糖粗提液、除蛋白后的灵芝多糖粗提液和透析后的灵芝多糖粗提液六种冻干样品分别进行NIR测定，根据光谱谱线收敛情况选择波数范围为4900～4667cm‑1和4553～4000cm‑1，建立基于偏最小二乘的多糖分析模型；(6)将验证集的测量的光谱导入上述多糖分析模型，对照利用硫酸蒽酮法测定的结果，利用所构建的模型进行结果预测。

【技术特征摘要】
1.一种基于NIR光谱技术的灵芝多糖定量方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用发酵方式获得灵芝菌丝体，并制备灵芝菌丝体干粉；(2)对于灵芝菌丝体干粉，利用硫酸蒽酮法进行多糖测定；(3)并对灵芝菌丝体干粉进行NIR检测，波数范围为12500～4000cm-1，并收集光谱数据；(4)将测量光谱在12500～9000cm-1范围内截除，保留9000～4000cm-1光谱范围，进行矢量归一化后，选定一阶导数作为建模预处理方式；(5)建立校正集和验证集，利用校正集的硫酸蒽酮法测量结果和测量光谱构建定量模型，对灵芝多糖进行提取和纯化，并对灵芝浸提沉淀、灵芝浸提后上清液、灵芝上清液浓缩后粗多糖、醇沉复溶后的灵芝多糖粗提液、除蛋白后的灵芝多糖粗提液和透析后的灵芝多糖粗提液六种冻干样品分别进行NIR测定，根据光谱谱线收敛情况选择波数范围为4900～4667cm-1和4553～4000cm-1，建立基于偏最小二乘的多糖分析模型；(6)将验证集的测量的光谱导入上述多糖分析模型，对照利用硫酸蒽酮法测定的结果，利用所构建的模型进行结果预测。2.根据权利要求1所述的一种基于NIR光谱技术的灵芝多糖定量方法，其特征在于，所述步骤(1)中，制备灵芝菌丝体干粉的具体过程如下：将灵芝菌种取0.5cm2小块，接种于灭菌的马铃薯葡萄糖液体培养基中，28℃，180rpm摇床发酵培养，至菌丝体长满培养液，将菌丝体取出，4000rpm离心5min，弃上清，保留沉淀，即菌丝体，用无菌ddH2O清洗菌丝体，并离心2次，将菌丝体置于60℃下干燥，干燥后用研钵研磨成均匀干粉末，备用。3.根据权利要求2所述的一种基于NIR光谱技术的灵芝多糖定量方法，其特征在于，利用发酵方式获得灵芝菌丝体提取灵芝多糖的具体过程如下：取样品粉末2g，置于烧瓶中，加水60ml，80℃水浴加热1h，加热提取3h，5000rpm离心8min，保留上清，沉淀搅开，加水60ml，80℃水浴加热2小时，5000rpm离心8min，合并上清，置于水浴上蒸干，残渣加5ml ddH2O溶解，边搅拌边缓慢滴加无...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄青，马玉涵，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽;34