水稻IPA1基因的定点突变系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种水稻IPA1基因的定点突变系统及其应用。所述的定点突变系统为特异剪切水稻IPA1基因靶序列的类转录激活因子效应物核酸酶TALENs；所述的靶序列位于IPA1基因第三外显子，如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术根据所述靶序列构建植物TALENs表达载体并导入水稻中，获得了一系列IPA1基因功能失活的等位突变体，为水稻株型改良提供新的材料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种水稻IPA1基因的定点突变系统及其应用。
技术介绍
基因组编辑技术是一种在基因组水平上对DNA序列进行靶向修饰的遗传操作技术，可对作物基因组进行定点改造，实现作物的遗传改良。TALENs（类转录激活因子效应物核酸酶）技术是一种由序列特异核酸酶介导的基因组编辑技术，由黄单胞杆菌转录激活类效应子TALE和核酸内切酶FokⅠ的DNA切割域组成。其基本原理是TALEN二聚体特异识别并切割靶DNA序列产生双链断裂（double-strand breaks，DSB)），随后DSB会激活细胞的非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）修复机制，完成对靶基因的定点改造。目前，该技术已成功地应用于植物的遗传改良和植物功能基因组研究中。水稻是重要的粮食作物，随着水稻基因组研究的不断深入，越来越多控制水稻重要农艺性状的基因被分离与克隆，为进行水稻分子遗传改良奠定了良好的基础。IPA1是一个调控水稻株型的主效QTL基因，位于水稻第8号染色体上，包括3个外显子。IPA1编码类 Squamosa 启动子结合蛋白 OsSPL14，并受 RNA miR156的调控。IPA1与控制水稻分蘖侧芽生长负调控因子OsTB1的启动子结合，通过促进OsTB1基因的表达进而抑制分蘖；IPA1通过直接正调控水稻株型重要基因DEP1正向调节水稻株高、穗长及枝梗数。研究表明IPA1在其miR156结合位点处发生一个点突变，扰乱了miR156 对IPA1的降解作用，使得IPA1的表达量提高，由于突变后的IPA1仅出现一个氨基酸替换，不影响其正常功能，水稻出现分蘖减少，茎杆变粗，株高、穗粒数和千粒重增加。利用基因组编辑技术对需改良水稻材料中IPA1基因的miR156结合位点处进行定点突变，不仅可获得如上所述的miR156 结合位点丧失但IPA1功能正常的突变体，还可获得IPA1功能缺失的突变体，为水稻株型改良提供一系列分蘖、株高和穗粒数等农艺性状不同的水稻新材料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种水稻IPA1基因的定点突变系统，为水稻株型改良提供一系列分蘖、株高和穗粒数等农艺性状不同的水稻新材料。所述的定点突变系统包含一对能特异剪切水稻IPA1基因靶序列的类转录激活因子效应物核酸酶TALENs；所述的靶序列位于IPA1基因第三外显子如SEQ ID NO.1所示，由左侧TALN模块识别序列L、右侧TALN模块识别序列R和其间的间隔序列组成，中间的小写字母为间隔序列（序列为ctgtgctctctctcttc），两侧的大写字母为TALN模块识别序列，分别命名为L靶序列（序列为GCCGCCACCGACTCGAG）和R靶序列（序列为TGTCAACCCAGCCATGGGA）。根据L靶序列设计TALEN-L蛋白，包含TALE和FOK1的融合蛋白，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；根据R靶序列设计TALEN-R蛋白，包含TALE和FOK1的融合蛋白，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述类转录激活因子效应物核酸酶TALENs由TALEN-L和 TALEN-R组成，TALEN-L特异识别靶序列L，TALEN-R特异识别靶序列R。本专利技术的的另一个目的在于提供了一种获得水稻IPA1基因突变体的方法。包括在水稻中表达上述定点突变系统的所有步骤，具体为根据IPA1基因设计靶序列如SEQ ID NO.1所示，包括中间的间隔序列及两侧的TALN模块识别序列L和R。针对L和R序列合成TALEN-L和TALEN-R蛋白的基因表达盒构建于同一个植物表达载体中，通过农杆菌介导法导入水稻中，可以成功地获得IPA1基因发生突变的水稻突变体，实现对IPA1基因定点突变的实际需求。本专利技术的的另一个目的在于提供了一种植物TALENs表达载体，包含表达TALEN-L和 TALEN-R蛋白的基因表达盒，TALEN-L的表达由Ubiquitin启动子驱动，TALEN-R的表达由35S启动子驱动。Ubiquitin启动子序列如SEQ ID NO.4所示，35S启动子序列如SEQ ID NO.5所示。与现在技术相比，本专利技术的有益成果在于：1）利用TALENs基因组编辑技术可以实现IPA1基因的定向突变，克服了传统理化诱变技术具有随机突变及容易携带其不利突变基因的缺陷。2）利用TALENs基因组编辑技术可以快速地获得不同突变类型的ipa1突变体，为水稻株型改良提供丰富的种质资源。附图说明图1. TALENs靶序列在IPA1基因的相对位置。黑色方框表示外显子，白色方框表示5' 和3'非翻译区，TALENs靶序列位于IPA1基因第三外显子的3505-3556bp处。图2. TALENs植物表达载体结构示意图。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界，35S为烟草花椰菜花叶病毒35S启动子，Hyg为潮霉素抗性基因，Ubiquitin为玉米泛素基因启动子，T-nos为胭脂碱合成酶（nos）基因的终止子，TALEN-L为编码TALEN-L蛋白的基因序列，TALEN-L为编码TALEN-R蛋白的基因序列。图3. TALENs介导的IPA1基因突变类型。WT为野生型序列，阿拉伯数字表示发生缺失或增加的碱基数（数字前面加“-”表碱基缺失，数字前面加“+”表碱基增加），下划线为TALEN-L和TALEN-R蛋白识别的靶序列L和R。图4. TALENs介导的IPA1基因突变植株表型。IPA1-CK为杂合突变体后代分离得到野生型植株，IPA1-2为缺失2bp的T2代纯合突变体植株，IPA1-4为缺失4bp的T2代纯合突变体植株，IPA1-16为缺失16p的T2代纯合突变体植株。具体实施方式下述实施例中所使用的实验验方法如没有特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。实施例1： TALENs靶序列的设计利用PCR扩增和测序获得籼稻恢明恢86背景下的IPA1基因序列，比对分析发现明恢86的IPA1基因序列与野生型IPA1基因序列一致。根据TALENs靶序列设计原则，在籼稻明恢86背景下IPA1基因的miRNA156结合位点附近设计TALENs靶序列，序列如下：GCCGCCACCGACTCGAGctgtgctctctctcttcTGTCAACCCAGCCATGGGA（SEQ ID NO.1）。中间小写字母为间隔序列，两侧的大写字母为TALENs模块识别序列，分别命名为靶序列L和靶序列R。实施例2： TALENs识别模块的合成及植物表达载体的构建根据DNA碱基与TALE蛋白RVDs区的对应关系，按照上述设计的靶序列L和R合成对应的TALE串联重复区，并分别构建于骨架载体pTALEN-L22和pTALEN-R16中（购于上海斯丹赛生物技术有限公司），经SpeI和BamHI双酶切和测序验证获得重组载体pTALEN-L和pTALEN-R，测序引物序列为305: 5’ CTCCCCTTCAGCTGGACAC 3’和306: 5’ AGCTGGGCCACGATTGAC 3’。pTALEN-L含有表达TALEN-L蛋白的基因表达盒，包含Ubiquitin启动子、TALE蛋白-N端、串联重复区、C端和FokI切割域编码序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻IPA1基因的定点突变系统，其特征在于：包含一对能特异剪切水稻IPA1基因靶序列的类转录激活因子效应物核酸酶TALENs，所述的靶序列位于IPA1基因第三外显子，如SEQ ID NO.1所示，由左侧TALN模块识别序列L、右侧TALN模块识别序列R和其间的间隔序列组成。

【技术特征摘要】
1.一种水稻IPA1基因的定点突变系统，其特征在于：包含一对能特异剪切水稻IPA1基因靶序列的类转录激活因子效应物核酸酶TALENs，所述的靶序列位于IPA1基因第三外显子，如SEQ ID NO.1所示，由左侧TALN模块识别序列L、右侧TALN模块识别序列R和其间的间隔序列组成。2.根据权利要求1所述的定点突变系统，其特征在于，所述类转录激活因子效应物核酸酶TALENs由TALEN-L和 TALEN-R组成，TALEN-L特异识别靶序列L，TALEN-R特异识别靶序列R。3.根据权利要求2所述的定点突变系统，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：周淑芬，王锋，孙庆山，刘华清，林雅容，朱义旺，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35