本发明专利技术公开了一种用于植物多基因表达载体构建的质粒体系及其应用。通过对大肠杆菌质粒载体pUC18和双核农杆菌Ti质粒pBI121进行改造，形成了重组质粒pKAFCR0和pKAFCR100。pKAFCR0具有植物基因表达最常用的35S启动子和NOS终止子，并在其上游、中间和下游引入了多个克隆酶切位点，利用PCR等方法克隆得到的目的基因片段可以多种方式连接到pKAFCR0的35S与NOS中间；pKAFCR100具有卡那霉素NPT II耐性基因和sGFP绿色荧光蛋白报告基因，以及其中间的多克隆酶切位点。pKAFCR0与pKAFCR100两个质粒的配套使用，可以方便地构建植物单个或多个基因表达载体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物领域，具体涉及一种用于植物多基因表达载体构建的质粒体系及其应用。
技术介绍
植物基因工程技术的迅速发展和广泛应用为植物的遗传改良开拓了广阔的前景。该技术克服了植物有性杂交的限制，可将来源于不同物种甚至人工合成的基因导入植物，从而改良植物性状，培育优质高产作物新品种。在基因克隆、基因功能分析以及基因转化等分子生物学的研究与应用过程中，载体构建是常用的技术手段，采用合适的表达载体和构建方法会使实验效果事半功倍。但是，目前常用于植物基因表达载体构建的质粒，如pBIN19(Bevan，1984)、pBI121(Jefferson，1987)、pIG121-Hm(Ohta et al.，1999)、pMSIsGFP(Kawasaki et al.，1999)等质粒载体，由于其T-DNA领域中限制性内切酶位点有限，目的基因片段难于插入和连接，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，而且这些经典的质粒载体，目前只限于在研究者同行间互相转让，没有商业化，在使用上不尽如人意。为此，一些国际生物大公司，如Invitrogen公司创立了TOPO克隆(Patel，2009)、Gateway重组技术(Chung et al.，2005)，ClonTech公司创立了Infusion PCR技术(Berrow et al.，2007)等。TOPO克隆虽然简单，但目的载体范围有限，Gateway和infusion PCR可以不考虑酶切位点，但这些企业开发的技术和载体，主要针对的是动物、微生物的基因表达载体的构建，缺少植物基因表达所必须的启动子、终止子、筛选标记等功能元件，而且费用都比较昂贵(3000-10000元左右)，加上由于专利限制，只能应用于研究目的，在应用上受到了限制。另外，目前这些常用的质粒载体和开发的技术，大部分只能构建单个基因表达载体，然而在植物基因改良中，很多性状是由多个基因共同控制的，即要求几个相关基因的协同表达，常常需要构建多个基因表达载体。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术通过对最常用的大肠杆菌质粒载体pUC18和双核农杆菌Ti质粒pBI121进行全方位改造，并插入植物基因表达常用的启动子、终止子、筛选标记等功能元件，同时引入多个克隆酶切位点，建立了一套用于植物单个或多个基因表达载体构建的质粒体系，并提供了该质粒体系的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：用于植物多基因表达载体构建的质粒体系，包括pKAFCR0质粒和pKAFCR100质粒；所述pKAFCR0质粒通过以下步骤构建：S11、利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对大肠杆菌质粒载体pUC18(Yanisch-Perron et al.，1985)DNA进行双酶切处理；主要目的是切除其多克隆位点MCS(multiple cloning site)的Hind III至EcoR I部分；S12、同样利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对双核农杆菌Ti质粒pBI121 DNA进行双酶切处理；主要目的是切取其包含植物转基因时最常使用的35S启动子(cauliflower mosaic virus 35S promoter)、GUS(β-glucuronidase)报告基因和NOS终止子(nopaline synthase terminator)的片段。S13、将双酶切后的pUC18，以及同样双酶切后的pBI121，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒(如QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit)获得已切除Hind III-EcoR I部分的pUC18和从pBI121切取的35S-GUS-NOS片段；S14、利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒(如TOYOBO Ligation High Kit)，将已切除Hind III-EcoR I部分的pUC18和从pBI121切取的35S-GUS-NOS片段进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；S15、将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒(35S-GUS-NOS片段已插入到pUC18的Hind III和EcoR I位点)的阳性菌落；S16、将阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒(如QIAGEN Qiaprep Spin Miniprep Kit)提取重组质粒DNA，该重组质粒命名为pKAFCR1，即在pUC18的Hind III和EcoR I位点上，插入35S-GUS-NOS片段；S17、利用限制性内切酶Sma I和Sac I，对重组质粒pKAFCR1 DNA进行双酶切处理；主要目的是切除GUS报告基因片段。S18、将双酶切后的pKAFCR1经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒，获得已切除GUS报告基因片段的pKAFCR1；S19、人工合成一段DNA，该片段含有限制性内切酶Sma I、Kpn I、Xho I和Sac I位点；利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒(如TOYOBO Ligation High Kit)将该DNA片段与切除GUS报告基因的pKAFCR1进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒(如QIAGEN Qiaprep Spin Miniprep Kit)提取重组质粒DNA；该重组质粒命名为pKAFCR2，即去除了pKAFCR1的GUS报告基因，并在此位置上增加了Kpn I和Xho I酶切位点；S120、利用限制性内切酶Hind III和Pst I，对重组质粒pKAFCR2 DNA进行双酶切处理；S121、将双酶切后的pKAFCR2经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒，获得已酶切的pKAFCR2。S122、人工合成一段DNA，该片段含有限制性内切酶Hind III、Hpa I、Stu I、Sph I和Pst I(Sbf I)位点；利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒(如TOYOBO Ligation High Kit)将该DNA片段与已酶切的pKAFCR2进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒(如QIAGEN Qiaprep Spin Miniprep Kit)提取重组质粒DNA；该重组质粒命名为pKAFCR0，即在35S上游增加了Hpa I、Stu I和Sph I酶切位点；pKAFCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于植物多基因表达载体构建的质粒体系，其特征在于，包括pKAFCR0质粒和pKAFCR100质粒；所述pKAFCR0质粒通过以下步骤构建：S11、利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对大肠杆菌质粒载体pUC18DNA进行双酶切处理；S12、同样利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对双核农杆菌Ti质粒pBI121 DNA进行双酶切处理；S13、将双酶切后的pUC18，以及同样双酶切后的pBI121，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒获得已切除Hind III‑EcoR I部分的pUC18和从pBI121切取的35S‑GUS‑NOS片段；S14、利用T4‑DNA连接酶或质粒连接用试剂盒，将已切除Hind III‑EcoR I部分的pUC18和从pBI121切取的35S‑GUS‑NOS片段进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；S15、将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；S16、将阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA，该重组质粒命名为pKAFCR1，即在pUC18的Hind III和EcoR I位点上，插入35S‑GUS‑NOS片段；S17、利用限制性内切酶Sma I和Sac I，对重组质粒pKAFCR1 DNA进行双酶切处理；S18、将双酶切后的pKAFCR1经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒，获得已切除GUS报告基因片段的pKAFCR1；S19、人工合成一段DNA，该片段含有限制性内切酶Sma I、Kpn I、Xho I和Sac I位点；利用T4‑DNA连接酶或质粒连接用试剂盒将该DNA片段与切除GUS报告基因的pKAFCR1进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA；该重组质粒命名为pKAFCR2，即去除了pKAFCR1的GUS报告基因，并在此位置上增加了Kpn I和Xho I酶切位点；S120、利用限制性内切酶Hind III和Pst I，对重组质粒pKAFCR2 DNA进行双酶切处理；S121、将双酶切后的pKAFCR2经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒，获得已酶切的pKAFCR2。S122、人工合成一段DNA，该片段含有限制性内切酶Hind III、Hpa I、Stu I、Sph I和Pst I(Sbf I)位点；利用T4‑DNA连接酶或质粒连接用试剂盒将该DNA片段与已酶切的pKAFCR2进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA；该重组质粒命名为pKAFCR0，即在35S上游增加了Hpa I、Stu I和Sph I酶切位点；pKAFCR0在35S上游，35S与NOS中间以及在NOS下游均具有多克隆酶切位点；所述pKAFCR100质粒通过以下步骤构建：S21、利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对双核农杆菌Ti质粒pBI121DNA进行双酶切处理；S22、利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对双核农杆菌Ti质粒pBsGFPDNA进行双酶切处理；S23、将双酶切后的pBI121，以及同样双酶切后的pBsGFP，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒，获得已切除35S‑GUS‑NOS片段的pBI121，以及从pBsGFP切取的35SΩ‑sGFP‑NOS片段；S24、利用T4‑DNA连接酶或质粒连接用试剂盒，将已切除35S‑GUS‑NOS片段的pBI121和从pBsGFP切取的35SΩ‑sGFP‑NOS片段进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经50mg/L卡那霉素的LB液体培养基扩繁后，...
【技术特征摘要】
1.用于植物多基因表达载体构建的质粒体系，其特征在于，包括pKAFCR0质粒和pKAFCR100质粒；所述pKAFCR0质粒通过以下步骤构建：S11、利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对大肠杆菌质粒载体pUC18DNA进行双酶切处理；S12、同样利用限制性内切酶Hind III和EcoR I，对双核农杆菌Ti质粒pBI121 DNA进行双酶切处理；S13、将双酶切后的pUC18，以及同样双酶切后的pBI121，经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒获得已切除Hind III-EcoR I部分的pUC18和从pBI121切取的35S-GUS-NOS片段；S14、利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒，将已切除Hind III-EcoR I部分的pUC18和从pBI121切取的35S-GUS-NOS片段进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；S15、将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；S16、将阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA，该重组质粒命名为pKAFCR1，即在pUC18的Hind III和EcoR I位点上，插入35S-GUS-NOS片段；S17、利用限制性内切酶Sma I和Sac I，对重组质粒pKAFCR1 DNA进行双酶切处理；S18、将双酶切后的pKAFCR1经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒，获得已切除GUS报告基因片段的pKAFCR1；S19、人工合成一段DNA，该片段含有限制性内切酶Sma I、Kpn I、Xho I和Sac I位点；利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒将该DNA片段与切除GUS报告基因的pKAFCR1进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂于含有25mg/L青霉素的LB固体培养基上培养，挑取单独菌落进行菌落PCR鉴定，筛选含有重组质粒的阳性菌落；将阳性菌落经25mg/L青霉素的LB液体培养基扩繁后，利用常规的质粒提取方法或质粒提取试剂盒提取重组质粒DNA；该重组质粒命名为pKAFCR2，即去除了pKAFCR1的GUS报告基因，并在此位置上增加了Kpn I和Xho I酶切位点；S120、利用限制性内切酶Hind III和Pst I，对重组质粒pKAFCR2 DNA进行双酶切处理；S121、将双酶切后的pKAFCR2经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，切取目的条带，通过凝胶回收方法或凝胶回收试剂盒，获得已酶切的pKAFCR2。S122、人工合成一段DNA，该片段含有限制性内切酶Hind III、Hpa I、Stu I、Sph I和Pst I(Sbf I)位点；利用T4-DNA连接酶或质粒连接用试剂盒将该DNA片段与已酶切的pKAFCR2进行连接；连接后的重组质粒，利用热激发转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌平涂...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈任，张虹，张芮，周涛，安韶雅，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：宁夏;64
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