本发明专利技术涉及生物化学、分子生物学、生物技术领域，具体而言，涉及一种核糖核酸酶及其衍生物和/或变体，该核糖核酸酶及其衍生物和/或变体对温度、pH以及离子条件等适应范围较广，而且RNA切割活性较高，弥补了一些RNase酶切条件苛刻的不足，并且反应条件温和，具有很好的商业应用前景与较高的研究价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学、分子生物学、生物
，具体而言，涉及一种核糖核酸酶及其衍生物和/或变体及其应用。
技术介绍
核糖核酸酶RNase(EC3.1.26/27.—)和(EC 2.7.—.—)，是核酸酶的一种，可以催化RNA的降解成小分子。核糖核酸酶广泛存在于微生物、动植物之中。不同来源的核糖核酸酶其作用方式也存在差异，根据其作用位点的不同可以分为核酸内切酶和核酸外切酶。其中RNase A(EC 3.1.27.5)，来源于牛的胰脏，被广泛应用于实验室中RNA的去除实验中，而且大量的研究表明，它可以用于抗病毒，抗肿瘤的治疗之中。它可以切割RNA 3’末端非配对的嘧啶核苷酸(C和U)，通过2’,3’-环化的单磷酸中间产物形成3’-磷酸化的产物。该蛋白可以专一性的降解单链的RNA，其结构以及具体的作用机制已经阐明。此后又有多种RNase被发现。比如可以切割DNA-RNA杂交产物中的RNA的RNaseH。专一性切割单链RNA 3’末端非配对的G的RNaseT1等。RNase不仅具有RNA的降解功能，其中一部分还参与了细胞的多种其他生理功能，比如RNA的生成，RNA可变剪切体的形成，抗病毒等。随着科学研究的深入，多种RNase被发现，而且其作用的具体机制、作用的位点等都被一一阐明，新的RNase也被不断地发现。人类基因组计划完成以来，新的基因不断被发现，但是有很多基因其功能未知。未知功能基因C19orf43，少有被提起，仅在7篇左右的文献中有过提及但是关于该基因的具体功能未做任何阐明。人C19orf43(Chromosome 19open reading frame 43)基因定位于人19号染色体短臂13.2区段，该基因的同源基因广泛存在于真核生物中，从昆虫到人类的细胞中都发现了该基因同源基因的存在。C19orf43基因编码一个含有176个氨基酸，分子量为18.42KDa的蛋白，UniProt中蛋白编号为：Q9BQ61(CS043_HUMAN)。广泛存在于人体的各种组织和器官中，在细胞核以及细胞器中均发现其表达。但是没有关于该蛋白功能的任何报道。本专利技术的目的是克隆并表达纯化该蛋白，证明了该蛋白的功能，并阐述了该蛋白在RNA降解中的具体作用机制。细胞中的C19orf43蛋白，其可以降解RNA，同时也可能参与了其他的生理过程，其它重要的用途仍然有待研究。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种核糖核酸酶及其衍生物和/或变体以解决上述问题。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种核糖核酸酶及其衍生物和/或变体，其具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的核糖核酸酶活性片段。SEQ ID NO:1所示的核糖核酸酶活性片段分离于RNase蛋白的基因C19orf43(Chromosome 19open reading frame 43)的一个结构域，是C19orf43蛋白中起切割RNA活性的主要结构域。在本专利技术的一个实施例中，提供了对C19orf43全长蛋白及其各种缺失突变体的Rnase活性检测，从其中可见具有SEQ ID NO:1所示的核糖核酸酶活性片段的衍生物和/或变体均具有RNase活性。本专利技术请求保护SEQ ID NO:1所示的核糖核酸酶活性片段及包含该片段的、具有RNase活性的各种衍生物和/或变体。如上所述的核糖核酸酶及其衍生物和/或变体切割RNA时的反应条件为：37℃～75℃，pH 6.5～12。本专利技术提供的核糖核酸酶及其衍生物和/或变体对温度、pH以及离子条件等适应范围较广，而且RNA切割活性较高，弥补了一些RNase酶切条件苛刻的不足，并且反应条件温和，具有很好的商业应用前景与较高的研究价值。一种分离的核酸分子，所述核酸分子选自如下核酸：A)、DNA或RNA，编码权利要求1所述的核糖核酸酶及其衍生物和/或变体；B)、与A)中定义的核酸互补的核酸。本专利技术所请求保护的DNA分子还包括与此相关的cDNA序列。优选的，所述分离的核酸分子包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列。SEQ ID NO:2所示的核酸序列即编码SEQ ID NO:1所示的核糖核酸酶活性片段的蛋白序列。一种载体，其包括如上所述的核酸分子。一种宿主细胞，其被如上所述的载体转化。在本专利技术的一个实施例中，优选该载体为原核表达载体pET33b(+)，优选该宿主细胞为大肠杆菌Ecoli BL21(DE3)细胞。一种制备如上所述的核糖核酸酶及其衍生物和/或变体的方法，包括如下步骤：在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞；从所培养的宿主细胞的裂解液中分离纯化得到所述核糖核酸酶及其衍生物和/或变体。一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的核糖核酸酶及其衍生物和/或变体。如上所述的核糖核酸酶及其衍生物和/或变体的抑制剂。优选的，所述抑制剂包括Zn2+、EDTA、EGTA。其中EDTA和EGTA起到部分抑制该核糖核酸酶及其衍生物和/或变体的作用。本专利技术成功构建并表达纯化了C19orf43蛋白，并证明了C19orf43蛋白RNA切割的功能，阐述了RNA切割中的具体作用位点与机制，同时探讨了在RNA切割过程中该酶所需要的条件，发现该酶在RNA降解，合成等研究领域具有广泛的用途。除RNA切割功能之外，极大可能参与了细胞的其他生理功能，目前尚未可知。同时，本专利技术也为未知RNase的发现与功能研究提供了新的思路与参考。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为C19orf43基因PCR扩增胶图；图2为C19orf43蛋白诱导表达的染色图片；图3为C19orf43蛋白经pure纯化后各组分染色图片；图4为各种不同类型RNA切割结果；图5为时间和温度对C19orf43蛋白切割RNA的影响；图6为pH对C19orf43蛋白切割RNA的影响；图7为不同离子条件对C19orf43蛋白切割RNA的影响；图8为C19orf43蛋白截短体的构建与RNA切割活性验证；图9为C19orf43蛋白切割RNA的机制。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本专利技术的目的是通过人C19orf43基因克隆、蛋白诱导表达纯化，体外RNA切割实验等方法，阐明C19orf43蛋白切割RNA的机制。以及阐述其应用的前景。本专利技术提供了人C19orf43基因克隆，质粒构建，蛋白诱导表达纯化，体外RNA切割实验的具体实施步骤；在实施例中，本专利技术提供了如下操作的具体内容：cDNA文库的获得：HeLa-S3细胞培养好后，提取RNA，使用MMLV逆转录酶，构建cDNA文库的具体步骤。C19orf43基因的克隆：用构建的cDNA文库为PCR的模板，扩增C19orf43片段，胶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核糖核酸酶及其衍生物和/或变体，其特征在于，所述核糖核酸酶及其衍生物和/或变体具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的核糖核酸酶活性片段。
【技术特征摘要】
1.一种核糖核酸酶及其衍生物和/或变体，其特征在于，所述核糖核酸酶及其衍生物和/或变体具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的核糖核酸酶活性片段。2.根据权利要求1所述的核糖核酸酶及其衍生物和/或变体，其特征在于，所述核糖核酸酶及其衍生物和/或变体切割RNA时的反应条件为：37℃～75℃，pH 6.5～12。3.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子选自如下核酸：A)、DNA或RNA，编码权利要求1所述的核糖核酸酶及其衍生物和/或变体；B)、与A)中定义的核酸互补的核酸。4.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子包括SEQ ID ...
【专利技术属性】
技术研发人员：关武祥，解举民，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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