一种泰乐菌素高产菌株的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种泰乐菌素高产菌株的高通量筛选方法，属于微生物生产技术领域。本发明专利技术建立了一种新型的高通量筛选的方法。本发明专利技术方法有效提高了孢子生长速度，有效提高了后续筛选效率。同时，本发明专利技术通过对进行优化，得到了线性关系好的检测方法，有效提高了筛选的效率和准确性，防止了提取效果不佳导致的筛选准确性不足的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种泰乐菌素高产菌株的高通量筛选方法，属于微生物生产

技术介绍
泰乐菌素(Tylosin)又称泰乐星、泰勒霉素，是一种16元大环内酯类抗生素，它是一种禽、畜专用的高效无残留的抗菌促生剂，广泛应用于饲料、兽药添加剂。泰勒菌素工业生产菌为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)。泰乐菌素主要是由泰乐菌素A、脱碳霉糖泰乐菌素B、大菌素C和雷洛菌素D四种组分组成，其中A组分具有最强的生物活性。泰勒菌素生物合成过程十分复杂，具体明确的生物合成途径尚未阐明。通过分子生物学和基因工程技术，改造泰乐菌素的生物合成基因簇仍在不断探索之中。基于抗生素遗传背景的分子育种手段过程复杂，费用大，成功率低。对于泰乐菌素的工业化生产，出发菌株必须满足一定的优良特性。经典诱变使用理化方法诱导DNA突变，方法简单，适用范围广。高通量筛选技术结合经典诱变简化筛选过程，提高了筛选效率。目前的泰乐菌素高产菌株，一般是采用摇瓶发酵后用HPLC方法进行检测，存在培养周期长、检测所需时间长、检测方法繁琐等缺陷。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种泰乐菌素高产菌株的高效筛选方法。本专利技术方法结合了常压室温等离子体(ARTP)、酶标仪检测和高通量筛选技术，提高泰乐菌素高产菌株的筛选效率。所述出发菌株齐鲁制药(内蒙古)有限公司提供。本专利技术的泰乐菌素高产菌株的高效筛选方法，主要包括步骤如下：(1)将待筛选的弗氏链霉菌菌悬液涂布在固体平板培养基上，待孢子成熟后挑选接种于装有种子培养液的96浅孔板中培养；(2)将96浅孔板中得到的种子液平行转接至装有发酵培养液的48孔板中发酵培养；(3)发酵结束后，离心取菌体，吸取上清液用0.1mol/LHCl稀释至泰乐菌素浓度为0～330μg/mL，然后取稀释液200μL稀释液于96酶标板，酶标仪测定OD290值，根据y＝0.0116x+0.0414(其中，x为泰乐菌素浓度(μg/mL)，y为OD290nm)计算得到泰乐菌素浓度，进而根据稀释倍数换算得到发酵液的泰乐菌素浓度，即得到产泰乐菌素相对较高的菌株。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的固体平板培养基上的培养是在30℃培养4d。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的固体平板培养基配方(g/L)：蔗糖10g，大豆蛋白胨1g，酵母粉1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 1g，琼脂20g，pH调节至7.2。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的种子培养液(g/L)：豆饼粉5g，酵母粉5g，玉米浆6g，轻质CaCO33g，豆油4mL，pH调节至7.18。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的96浅孔板中培养是在750r/min、30℃摇床培养2d。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)的发酵培养液(g/L)：鱼粉10.5g，玉米粉17g，玉米淀粉10.5g，甜菜碱0.37g，NaCl 0.1g，KCl 0.9g，(NH4)2HPO 4g，NiSO43g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaCO31.9g。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)的发酵培养是将种子液以10％(v/v)的接种量转接至48孔板中，于750r/min、30℃发酵培养6d。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)的离心是在4000r/min离心15min。在本专利技术的一种实施方式中，所述待筛选的弗氏链霉菌菌悬液，是将弗氏链霉菌进行诱变后得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述诱变，可以是物理诱变或者化学诱变，比如常压室温等离子体(ARTP)诱变、紫外诱变、甲基磺酸乙酯(EMS)诱变、亚硝基胍(NTG)诱变、硫酸二乙酯(DES)诱变等等。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)96浅孔板中种子培养液添加量为200μL/孔。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)48孔板中发酵培养液的添加量为900μL/孔。本专利技术的有益效果：本专利技术建立了一种新型的高通量筛选的方法。本专利技术方法有效提高了孢子生长速度，有效提高了后续筛选效率。同时，本专利技术通过对进行优化，得到了线性关系好的检测方法，有效提高了筛选的效率和准确性，防止了提取效果不佳导致的筛选准确性不足的问题。附图说明：图1：泰乐菌素浓度与OD的关系曲线。具体实施方式泰乐菌素的测定：高效液相色谱(HPLC)仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18流动相：16.8％高氯酸钠(用HCL调节pH至2.5)+40％乙腈+43.2％去离子水流速：1.0mL/min柱温：35℃进样量：10μL紫外检测器波长：290nm(检测泰乐菌素)样品制备：取一定量的发酵液，用20％的Al2(SO4)3调节pH至4.01～4.10，用滤纸过滤得滤液，滤液经过适当的稀释处理和经0.22μL滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。致死率的计算：其中A表示空白对照平板上的菌落形成单位个数，B表示经过诱变处理后平板上的菌落形成单位个数。所需培养基：平板培养基(g/L)：蔗糖10g，大豆蛋白胨1g，酵母粉1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O1g，琼脂20g，pH调节至7.2。种子培养基(g/L)：豆饼粉5g，酵母粉5g，玉米浆6g，轻质CaCO33g，豆油4mL，pH调节至7.18。发酵培养基(g/L)：鱼粉10.5g，玉米粉17g，玉米淀粉10.5g，甜菜碱0.37g，NaCl 0.1g，KCl 0.9g，(NH4)2HPO 4g，NiSO43g，MgSO4·7H2O 0.1g，CaCO31.9g。实施例1：ARTP诱变出发菌株斜面菌种在29℃培养6天，刮取适量孢子于装有2mL无菌生理盐水试管中，振荡器振匀制成菌悬液后无菌滤纸过滤。吸取10μL合适浓度的菌悬液均匀涂布于无菌的载片表面，将载片置于载台上，用ARTP诱变仪进行诱变。条件：入射功率为100W、氦气流量为10SLM、分别照射0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s，样品处理完毕，用无菌镊子将载片放至装有1mL生理盐水的EP管中振荡洗脱后梯度稀释。分别吸取100μL稀释后的菌悬液涂布固体平板上(每组做3组平行)。29℃恒温培养箱中培养6天后，孢子成熟。计数每块平板上的菌落形成单位个数，再计算出每个诱变处理时间的致死率，进而得到在入射功率为100W，氦气流量为10SLM条件下的致死曲线。实施例2：酶标仪检测根据泰勒菌素在290nm处有最大光吸收这一特点，选择酶标仪检测泰乐菌素OD值作为初筛方法。配置一定浓度梯度的标准品，用酶标仪检测，制得标准曲线方程y＝0.0116x+0.0414，R2＝0.9998。x为标准品浓度(μg/mL)，y为OD290nm，标准品浓度范围为0～330μg/mL。装有培养液48孔板4000r/min离心15min，取上清用0.1mol/L HCl稀释一定倍数，取200μL稀释液于96酶标板，用酶标仪测定290nm可见光下的吸光值OD。实施例3：高产菌株的筛选将ARTP诱变或其他诱变技术处理不同时间后的菌悬液稀释成合适的浓度，吸取100本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种泰乐菌素高产菌株的高效筛选方法，其特征在于，所述方法主要包括步骤如下：(1)将待筛选的弗氏链霉菌菌悬液涂布在固体平板培养基上，待孢子成熟后挑选接种于装有种子培养液的96浅孔板中培养；(2)将96浅孔板中得到的种子液平行转接至装有发酵培养液的48孔板中发酵培养；(3)发酵结束后，离心取菌体，吸取上清液用0.1mol/LHCl稀释至泰乐菌素浓度为0～330μg/mL，然后取稀释液200μL稀释液于96酶标板，酶标仪测定OD290值，根据y＝0.0116x+0.0414(其中，x为泰乐菌素浓度(μg/mL)，y为OD290nm)计算得到泰乐菌素浓度，进而根据稀释倍数换算得到发酵液的泰乐菌素浓度，即得到产泰乐菌素相对较高的菌株。

【技术特征摘要】
1.一种泰乐菌素高产菌株的高效筛选方法，其特征在于，所述方法主要包括步骤如下：(1)将待筛选的弗氏链霉菌菌悬液涂布在固体平板培养基上，待孢子成熟后挑选接种于装有种子培养液的96浅孔板中培养；(2)将96浅孔板中得到的种子液平行转接至装有发酵培养液的48孔板中发酵培养；(3)发酵结束后，离心取菌体，吸取上清液用0.1mol/LHCl稀释至泰乐菌素浓度为0～330μg/mL，然后取稀释液200μL稀释液于96酶标板，酶标仪测定OD290值，根据y＝0.0116x+0.0414(其中，x为泰乐菌素浓度(μg/mL)，y为OD290nm)计算得到泰乐菌素浓度，进而根据稀释倍数换算得到发酵液的泰乐菌素浓度，即得到产泰乐菌素相对较高的菌株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的固体平板培养基上的培养是在30℃培养4d。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的固体平板培养基配方(g/L)：蔗糖10g，大豆蛋白胨1g，酵母粉1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 1g，琼脂20g，pH调节至7.2。4.根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，曾伟主，曹晓梅，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32