本发明专利技术涉及一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，具体制备步骤为：1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGGAGA AAAA‑‑且重复片段结构域为16mer、32mer、64mer或96mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含130‑170mM的NaCl；将纯化后所得溶液在空气中对流浓缩后，得到重组蜘蛛丝蛋白水溶液；2)将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片挤出，凝固、在空气中卷绕和在拉伸浴中拉伸2‑4倍后得到重组蜘蛛丝纤维。本发明专利技术制备的重组蜘蛛丝纤维力学性能优良，微纤结构紧密，纤维表面光滑，纤维的平均断裂强度为480‑680MPa，平均断裂伸长率为15‑25％，本发明专利技术可应用于仿生纺丝领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于仿生纺丝领域，涉及一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法。
技术介绍
有着“生物钢”之称的天然蜘蛛丝是自然界最好的结构和功能材料之一，其高比强度(约为钢铁的5倍)、优异弹性(约为芳纶的10倍)、坚韧性(断裂能180MJ/m3)和断裂伸长率(约为钢的30倍)是其它天然纤维与合成纤维所无法比拟的。蜘蛛可以根据不同的用途纺出七种性能各异的纤维，其中牵引丝由于其优异的力学性能受到广泛关注，牵引丝蛋白由MaSp1和MaSp2组成，其中MaSp1是蜘蛛牵引丝刚性性能的主要来源，而MaSp2则对蜘蛛丝的弹性有很大贡献。由于蜘蛛有同类相食的天性且蜘蛛丝种类繁多，因此不能通过饲养获得大量单一蜘蛛丝，目前通过基因工程技术，获得重组蜘蛛丝蛋白已被应用于探究蜘蛛丝的形成机理并进而指导人造蜘蛛丝的研究。所述重组蜘蛛丝蛋白是利用测定部分蜘蛛丝蛋白基因(cDNA)所获得的基因序列，应用基因工程技术得到的蛋白液。与合成人造纤维不同，天然蜘蛛丝是在常温常压、以水为溶剂等温和的条件下形成的。蜘蛛的纺丝系统是一个集离子调控、蛋白浓缩、剪切拉伸、纺丝于一体的集成过程，蜘蛛的纺丝通道形状参数符合二阶衰减指数模型。微流体技术可以利用微流体的层流及扩散特性，从通道尺寸、pH值、离子浓度及拉伸剪切等方面高度模拟生物体内的纺丝过程，以动态调控纺丝液的组成和结构。然而大部分重组蜘蛛丝的纺丝过程都会利用有机溶剂，如尿素、LiBr、六氟异丙醇(HFIP)、甲酸、盐酸胍等，一部分用于重组蜘蛛丝蛋白的溶解，一部分用作凝固浴。通过这种方式得到的蜘蛛丝纤维有两个劣势：(1)纤维中残留的具有毒性的有机溶剂限制了蜘蛛丝蛋白在医学材料方面的应用(2)纺丝方法均采用湿法纺丝方法，纤维的力学性能与天然蜘蛛丝的力学性能相比仍有较大差距(3)有些有机溶剂价格昂贵，限制了其进一步的大规模制备。Hagn等(Nature,2010,465(13),239-242.)发现在蜘蛛体内没有剪切力作用时，蛋白聚集程度由盐浓度决定，离液序列高的NaCl有利于蛋白存储，即使NaCl浓度高达500mM时蛋白聚集低于15％，且NaCl的存在使得蛋白存储过程更稳定。专利US2012/0231499A1将获得的Rep16、Rep32、Rep64、Rep96重组蜘蛛丝蛋白冷冻干燥后溶解在HFIP中，得到浓度为20％(w/v)的蛋白溶液，利用湿法纺丝技术，以1-2mL/h的速度通过注射器挤到体积百分数为90％的乙醇凝固浴中，初生纤维在凝固浴浸泡20min后剪为50mm的小段手动拉伸5倍，获得的32mer纤维断裂强度202±25MPa，断裂伸长率为3.27±0.32％，杨氏模量为8.28±0.85GPa；64mer纤维断裂强度为252±26MPa，断裂伸长率为4.31±0.64％，杨氏模量为10.14±0.67GPa；96mer纤维断裂强度为508±108MPa，断裂伸长率15±5％，杨氏模量21±4GPa。但该蛋白不含羧基端结构域(CTD)和氨基端结构域(NTD)，且有机溶剂的使用限制了应用。Aniela等(Adv.Mater.,2015,27(13),2189-2194.)设计的蛋白N端来自黑寡妇蜘蛛的MaSp1，重复段与C端来自十字园蛛的ADF3，冷冻干燥后溶解在异丙醇中，利用湿法纺丝技术，将浓度为10％-17％(w/v)的蛋白液，以5μL/min的速度从喷丝头挤出到体积百分数为90％的乙醇凝固浴中，并以5mm/sec的速度手动拉伸6倍，获得的N1L(AQ)12NR3纤维韧性189MJ/m3略超过天然蜘蛛丝但强度较低。Lin等(Adv.Mater.,2013,25,1216-1220.)将包卵丝蛋白的10个RP1Tu和1个RP2Tu，末端连接上小囊状腺丝MiSp1的C端CTDMi组成重组蜘蛛丝蛋白11RPC，冷冻干燥后的蛋白溶解于HFIP，利用湿法纺丝技术，将浓度为10mg/mL的蛋白液，以0.2mL/h的速度从喷丝头挤出到ZnCl2(100mM)和FeCl3(1mM)混合凝固浴中，体积百分数为50-70％乙醇水溶液共拉伸5倍，得到的纤维断裂强度308±57MPa，高出天然包卵丝30％，杨氏模量9.3±3GPa，高出天然包卵丝>50％。Asakura等(Biomacromolecules,2007,8,175-181.)发现桑蚕腺体管道腔体的半径变化趋势大致符合二阶衰减指数模型，此模型公式为：Y＝A(1/(1+exp(BX)))+C(1/(1+exp(DX)))，其中A＝238，B＝6.18E-05，C＝588，D＝0.003，R2＝0.988。Breslauer等(Biomacromolecules,2009,10,49-57.)根据Nephila clavipes蜘蛛腺体导管和桑蚕腺体的尺寸变化和流体在管壁内的流量变化，拟合出蜘蛛腺体半径(r,μm)对轴向位置函数(z,μm)的二阶指数函数：r(z)＝aebz+cedz，对于蜘蛛，a＝-0.004886μm，b＝0.0003718μm-1，c＝53.52μm，d＝-9.989*10-5μm-1(R2＝0.9735)，并作出了蜘蛛腺体流动参数和应变张量量级图示，表明蜘蛛腺体通道由107μm减小至10μm过程中，量级减小缓慢。Knight等(Proceedings of the Royal Society B,1999,266,519-523.)研究表明蜘蛛腺体通道和蚕一样以二阶指数迅速衰减。专利CN102162140A设计的微流体芯片，通道两侧面与水平面相交的迹线为指数函数曲线、双曲线函数曲线或直线中的一种以上。其中二阶指数函数公式与Breslauer等一致；双曲线公式为：R(x)＝1/2(ex-e-x)；一阶指数函数公式为：R(x)＝ea*ln(x)，其中a＝0.0125。专利W02007/141131(A1)和US2010029553(Al)利用层流扩散原理，设计了一种微流体芯片，实现了对再生丝素蛋白溶液的组成和金属离子浓度的调节，用于制备不同形态的蛋白制品。专利ZL201110007232.6设计了具有剪切拉伸功能的微流体芯片，与干纺结合，应用在再生丝素蛋白溶液体系，实现了对纺丝液的剪切拉伸。专利CN102995145A和CN102995145B设计的微流体芯片，模拟了生物纺丝过程中的复杂流场，实现了对纺丝液的剪切拉伸、组分调节和浓缩等，与干法纺丝工艺相结合，制得性能优良的再生丝素纤维，但与生物纺丝过程的多种作用相比，功能单一、仿生程度低。Rammensee等(PNAS,2008,6,6590-6595.)利用微流体技术将不同宽度的矩形通道组合在一起，研究了两种十字圆蛛蛋白eADF3、eADF4在微流体通道中的聚集机理，研究发现磷酸根和pH值以及剪切作用是重组蜘蛛丝蛋白的聚集形成纤维的必要条件，eADF3原纤只在拉伸流动时产生，eADF4只伴随eADF3产生本身没有自组装只有球状固体蛋白聚集。专利CN102134757A设计的微流体芯片模拟了蜘蛛和蚕纺丝过程中腺体内的复杂流场，实现了对纺丝液的剪切拉伸、组分调节和浓缩等，制得性能优良的再生丝素纤维。综上所述，目前还没有将微流体芯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，其特征是，制备步骤如下：1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAAA‑‑且重复片段结构域为16mer、32mer、64mer或96mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含130‑170mM的NaCl；将纯化后所得溶液在空气中对流浓缩后，得到重组蜘蛛丝蛋白水溶液；2)将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以3‑5μL/min的速度挤出，在凝固浴中固化成丝，并在空气中卷绕上辊，在拉伸浴中以0.5‑1.5mm/s的拉伸速度拉伸2‑4倍后得到重组蜘蛛丝纤维；所述微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为指数函数、双曲线函数或直线中的一种以上；所述重组蜘蛛丝纤维的力学性能优良，纤维的平均断裂强度为480‑680MPa，平均断裂伸长率为15‑25％。
【技术特征摘要】
1.一种将微流体芯片用于重组蜘蛛丝蛋白的纺丝方法，其特征是，制备步骤如下：1)将氨基酸序列为GGAGQGGYGGLGSQGTSGRGGLGGQGAGAAAAA--且重复片段结构域为16mer、32mer、64mer或96mer的重组蜘蛛丝蛋白进行纯化，纯化过程中所用的缓冲液均含130-170mM的NaCl；将纯化后所得溶液在空气中对流浓缩后，得到重组蜘蛛丝蛋白水溶液；2)将浓缩后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液通过微流体芯片以3-5μL/min的速度挤出，在凝固浴中固化成丝，并在空气中卷绕上辊，在拉伸浴中以0.5-1.5mm/s的拉伸速度拉伸2-4倍后得到重组蜘蛛丝纤维；所述微流体芯片的微通道的两侧面与水平面相交的迹线为指数函数、双曲线函数或直线中的一种以上；所述重组蜘蛛丝纤维的力学性能优良，纤维的平均断裂强度为480-680MPa，平均断裂伸长率为15-25％。2.根据权利要求1所述的纺丝方法，其特征在于，所述纯化后的重组蜘蛛丝蛋白水溶液中重组蜘蛛丝蛋白的浓度为1.5-3wt％，NaCl的浓度为130-170mM。3.根据权利要求1所述的纺丝方...
【专利技术属性】
技术研发人员：张耀鹏，鲁丽，彭庆法，夏小霞，秦看看，邵惠丽，胡学超，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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