一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip‑amu1及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip‑amu1及其制备方法和应用，免疫调节蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。制备方法包括：(1)将毒蝇鹅膏免疫调节蛋白的cDNA序列连入载体中，得到重组载体；(2)将上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；(3)培养上述重组菌株，诱导重组毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip‑amu1的表达；(4)经NI柱纯化、透析分离获取。所述免疫调节蛋白用于制备保健食品。本发明专利技术通过体外重组得到的毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip‑amu1能够明显促进脾淋巴细胞增殖、促进肿瘤坏死因子TNF‑α的表达等免疫调节作用，因此，在提高机体免疫力方面具有应用潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于真菌免疫调节蛋白领域，特别涉及一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1及其制备方法和应用。
技术介绍
真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein，FIP)是从高等担子菌中分离得到的一类具有免疫调节活性的小分子蛋白质。1989年，日本学者Kino从灵芝(Ganoderma lucidum)子实体中分离到第一个真菌免疫调节蛋白，命名为Ling Zhi-8(LZ-8)，并对其基因序列、氨基酸顺序和免疫生理活性进行了测定(Kino K,1989,J Biol Chem)。通过体外实验发现，真菌免疫调节蛋白可以促进小鼠脾细胞和人类周边血淋巴细胞的增生(Hsieh KY,2003,Clin Exp Allergy)，促进T淋巴细胞分泌表达黏附分子ICAM(Wu CT,2011,Carcinogenesis)，增强IL-2，TNF-α和IFN-γ的分泌水平(Li QZ,2011,Crit Rev Biotechnol)，从而提高机体免疫力。同时在动物实验中还观察到真菌免疫调节蛋白可以抑制小鼠产生全身性过敏，或降低局部性免疫过敏的发生率(Lin YL,2009,J Leukocyte Biol)，并且可以减轻一型糖尿病的病情(Kino K,1990,Diabetologia)，过敏和一型糖尿病都是由于机体免疫系统紊乱所致，而真菌免疫调节蛋白具有调节机体免疫系统恢复正常功能的作用。在抗癌方面，真菌免疫调节蛋白对于HL60肿瘤细胞具有很强的抗肿瘤活性(Huang L,2009,Proteins)。并且相对于许多成分复杂难解或化学结构不清楚(如灵芝多糖)的中草药来说，真菌免疫调节蛋白具有简单的化学结构，完全具备成药的条件。因此，真菌免疫调节蛋白拥有良好的临床应用前景和药用保健价值。目前，已经从灵芝(G.lucidium)、金针菇(Flammulina velutipes)、草菇(Volvariella volvacea)、松杉灵芝(G.tsugae)、紫芝(G.japoncium)、小孢子灵芝(G.microsporum)、甜灵芝(G.sinense)、拱状灵芝(G.fornicatum)、绵腐卧孔菌(Postia placenta)和赤球丛赤壳(Nectria haematococca)中发现真菌免疫调节蛋白，但是还未有在毒蝇鹅膏(Amanita muscaria)中发现真菌免疫调节蛋白的相关报道。在大型真菌中挖掘新型真菌免疫调节蛋白资源，对于我国进一步开发有关真菌免疫调节蛋白药物和保健食品，提高我国在食用菌资源开发方面的核心竞争力具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1及其制备方法和应用，该毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1能够明显促进脾淋巴细胞增殖、促进肿瘤坏死因子TNF-α的表达等免疫调节作用，因此，在提高机体免疫力方面具有应用潜力。本专利技术的一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1，所述免疫调节蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术的一种编码毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1的基因，所述基因的序列如SEQ ID NO.2所示。将毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1的cDNA序列在GenBank中进行BLAST比对，没有发现与其相似的基因序列，而将其氨基酸序列在NCBI的无冗余蛋白序列数据库(nr)中进行BLAST比对发现，该蛋白与来源于小孢子灵芝(G.microsporum)免疫调节蛋白的相似性达到55％，与来自于赤芝(Ganoderma lucidum)免疫调节蛋白LZ-8的相似性为50％。本专利技术的一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1基因的载体。优选的，所述载体为pET-32a。将本专利技术的毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。优选的，将毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1基因插入到pET-32a上的KpnI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组载体pET-Fip-amu1。本专利技术的一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1基因的重组菌株。优选的，所述重组菌株为Rosetta-Fip-amu1。本专利技术的一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1的制备方法，包括：(1)将毒蝇鹅膏免疫调节蛋白的cDNA序列连入载体中，得到重组载体；(2)将上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；(3)培养上述重组菌株，诱导重组毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1的表达；(4)经NI柱纯化、透析分离获取所表达的毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1。所述步骤(2)中的宿主细胞为大肠杆菌Rosetta细胞。本专利技术的一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1的应用，所述免疫调节蛋白用于制备保健食品。本专利技术运用基因工程手段获得，以及用于产业化生产毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1产品都未见报道。本专利技术首次提供了毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1，该蛋白对脾淋巴细胞具有催化分裂的作用，可作用于保健品和医药等工业。根据本专利技术的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1。有益效果本专利技术毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1能够明显促进脾淋巴细胞增殖、促进肿瘤坏死因子TNF-α的表达等免疫调节作用，因此，在提高机体免疫力方面具有应用潜力；可以制备出新型的提高人体免疫力的保健食品，防治由于免疫力下降所导致的疾病的危害，具有良好的应用前景。附图说明图1为本专利技术毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1氨基酸序列与其它真菌免疫调节蛋白氨基酸序列比对结果；图2为本专利技术pET-Fip-amu1质粒图谱；图3为本专利技术毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1表达的SDS-PAGE分析；其中，1为包涵体；2为上清；M为分子量标准；图4为本专利技术毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1的复性和纯化；图5为本专利技术毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1促进脾淋巴细胞增殖实验；图6为本专利技术毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1促进肿瘤坏死因子TNF-α的表达。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。下述是实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司买得。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。1.细胞株：Rosetta感受态，DH5a感受态。2.动物：清洁级ICR小鼠，体重18～22g，购于扬州大学实验动物中心。3.试剂盒、酶类、生化试剂和仪器：试剂盒：天根质粒提取试剂盒，天根蛋白定量检测试剂盒，上海生工PCR产物回收试剂盒，PCR引物合成和基因测序均由上海生工完成。TNF-αElisa检测试剂盒，CD4+CD62L+TCell分离试剂盒购于美国BD。酶类：Takara常规内切酶，Takara DNA T4连接酶，东盛TaqDNA聚合酶。仪器：艾本德微量加样器、赛默飞世尔离心机、酶联免疫分析仪，上海天本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip‑amu1，其特征在于：所述免疫调节蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1，其特征在于：所述免疫调节蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码如权利要求1所示的毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1的基因，其特征在于：所述基因的序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种含如权利要求2所述的毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1基因的载体。4.根据权利要求3所述的一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1基因的载体，其特征在于：所述载体为pET-32a。5.根据权利要求4所述的一种毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1基因的载体，其特征在于：将毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1基因插入到pET-32a上的KpnI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组载体pET-Fip-amu1。6.一种含如权利要求2所述的毒蝇鹅膏免疫调节蛋白Fip-amu1基因的重组菌株。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，高英女，汪滢，鲍大鹏，李燕，唐利华，茅文俊，周陈力，龚明，万佳宁，杨瑞恒，吴莹莹，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31