本发明专利技术提供一种生理性细胞自噬模型的建立方法以及黄嘌呤氧化酶在建立细胞自噬模型中的应用，以黄嘌呤氧化酶为自噬诱导剂建立细胞自噬模型，可在较长时间内持续、高效诱导细胞自噬。同时，并没有明显降低细胞活力，不会导致明显的细胞凋亡或坏死。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及生理性的细胞自噬模型的建立。
技术介绍
自噬(Autophagy)是一种通过溶酶体途径降解包括细胞器在内的胞质成分的分解代谢途径，在进化上高度保守且普遍存于真核细胞中。根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的差异，细胞自噬可分为：1)大自噬，通过起始(导致分割膜或吞噬泡的前自噬体结构的形成)、囊泡延伸、自噬体成熟以及自噬体-溶酶体融合、自噬体内容物被溶酶体酸性水解酶降解，最终自噬体内容物被释放以进行代谢再循环；2)小自噬，是指在溶酶体或酵母液泡表面通过突出、内陷或分隔隔离细胞器的膜来直接摄取待降解成分；3)分子伴侣介导的自噬，由胞质中的分子伴侣识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列并与之结合，分子伴侣-底物复合物与溶酶体膜上的受体LAMP2(lysosome associated membrane protein type 2)结合后，底物去折叠，溶酶体腔中的另一种分子伴侣介导底物在溶酶体膜的转位，然后底物在水解酶的作用下被分解再利用。随着自噬研究的深入，根据对降解底物的选择性不同，自噬又被分为线粒体自噬(mitophagy)、过氧化物酶体自噬(pexophagy)、内质网自噬(reticulophagy)、细胞核的碎片状自噬(piecemeal autophagy of the nucleus)、核糖体自噬(ribophagy)、脂肪自噬(lipophagy)、蛋白体聚集自噬(aggrephagy)、异体吞噬(xenophagy)等。已有的自噬模型往往自噬发生快、通量小，因而对其捕捉和检测造成困难，且常常与凋亡或坏死相伴发生，为自噬这一生理现象的研究造成干扰。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生理性细胞自噬模型的建立方法以及黄嘌呤氧化酶在建立细胞自噬模型中的应用，所建立的细胞自噬模型具有自噬发生显著、易于检测、持续时间久，并且不伴有细胞凋亡或坏死的优点。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种生理性细胞自噬模型的建立方法，该自噬模型的建立方法包括以下步骤：用黄嘌呤氧化酶对培养中的动物细胞进行处理。所述自噬模型的建立方法具体包括以下步骤：将动物细胞接种至培养器皿中并培养至动物细胞贴壁生长，然后向培养器皿中加入终浓度为1～40mU/mL的黄嘌呤氧化酶，并继续培养至少0.5小时。所述动物细胞接种量为1×104～3×105个。所述动物细胞贴壁生长至覆盖培养器皿底面积的50～60％后加入黄嘌呤氧化酶。所述动物选自哺乳动物。所述动物细胞选自上皮细胞或间质细胞。黄嘌呤氧化酶在建立细胞自噬模型中的应用。所述黄嘌呤氧化酶为自噬诱导剂。所述细胞自噬模型包括线粒体自噬。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术以黄嘌呤氧化酶为自噬诱导剂建立细胞自噬模型，可在较长时间内持续、高效诱导细胞自噬。同时，本专利技术所述细胞自噬模型的建立方法在能明显诱导自噬的黄嘌呤氧化酶剂量作用下并没有明显降低细胞活力，不会导致明显的细胞凋亡或坏死。附图说明图1A为XOD处理细胞后MDC荧光结果；Control为对照组结果，各个处理组的结果以左上角标注的代表XOD浓度的数字相区别(XOD浓度分别为1、5、10、20以及40mU/mL)，处理24h；图1B为XOD处理细胞后LC3蛋白免疫荧光结果；Control为对照组结果，各个处理组的结果以左上角标注的代表XOD浓度的数字相区别(XOD浓度分别为1、5、10、20以及40mU/mL)，处理24h；图1C为XOD处理细胞后透射电子显微镜(TEM)结果；Control为对照组结果，各个处理组的结果以左上角标注的代表XOD浓度的数字相区别(XOD浓度分别为1、5、10、20以及40mU/mL)，处理24h；图1D为XOD处理细胞后Western Blot及量化结果(处理24h)；0表示对照组结果；图1E为XOD处理细胞后自噬通量Western Blot检测结果(20mU/mL XOD处理24h)，＊表示p＜0.05，VS Control or XOD；图1F为采用mRFP-GFP-LC3串联的荧光蛋白表达载体系统对XOD处理细胞后自噬通量检测结果(20mU/mL XOD处理24h)；图1G为XOD处理多种细胞对自噬标志物LC3水平的Western Blot结果(处理24h)；图2A为经典自噬诱导剂Rapamycin、EBSS和XOD处理细胞后自噬水平比较(MDC荧光结果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM；图2B为经典自噬诱导剂Rapamycin、EBSS和XOD处理细胞后自噬水平比较(LC3免疫荧光结果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM；图2C为经典自噬诱导剂Rapamycin、EBSS和XOD处理细胞后自噬水平比较(TEM结果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM；图2D为经典自噬诱导剂Rapamycin、EBSS和XOD处理细胞后自噬水平比较(Western Blot及量化结果)；XOD：20mU/mL，Rapamycin：1μM，＊表示p＜0.05，VS each Control(2h/8h/24h)；图3为常用氧化剂及XOD对细胞凋亡及细胞活力的影响，＊表示p＜0.05，VS Control；其中，XOD：20mU/mL，(a)是Western Blot及量化结果，(b)是流式检测细胞死亡及量化结果，(c)是细胞生长曲线结果；图4为XOD诱导线粒体自噬的结果，＊表示p＜0.05，VS Control；其中，(A)是线粒体膜电位结果(JC-1染色共聚焦结果)，(B)是线粒体膜电位流式细胞仪量化结果，(C)是免疫荧光双标结果，(D)是线粒体自噬关键蛋白Western Blot及量化结果，(E)是透射电子显微镜结果，(F)是线粒体DNA拷贝数(荧光定量PCR)。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做详细说明。(一)主要实验部分1)黄嘌呤氧化酶(XOD)诱导自噬模型实验L-02细胞采用含10％(体积分数)FBS(胎牛血清)的MEM完全培养基为细胞培养液，在37℃并含有5％CO2及饱和湿度条件下培养细胞。处于对数生长期时，用2.5‰的胰蛋白酶(即质量分数2.5‰的胰蛋白酶溶液)将细胞消化至不再贴壁，混合MEM完全培养基均匀吹打制成细胞悬液，细胞悬液接种于6孔板等培养器皿中，起始细胞浓度为3×105个细胞/孔，37℃、5％CO2及饱和湿度条件的细胞培养箱中培养24小时至细胞贴壁生长，密度大约为覆盖培养器皿底面积的50～60％后，处理组分别加入终浓度1、5、10、20、40mU/mL的黄嘌呤氧化酶(XOD)进行处理(处理指加XOD并继续保持培养条件进行培养)24小时，然后检测细胞自噬及线粒体自噬。对照组(Control)加入相同体积水作为对照，后续处理及检测同处理组。2)类似地，采用XOD处理其他多种细胞如人肝细胞HepG2、人肺细胞BEAS-2B、人成纤维细胞WI-38、人皮肤细胞HaCat、以及大鼠肝细胞Clone 9、小鼠肝细胞AML12，处理组分别加入1、5、10、20、40mU/mL的XOD进行处理24小时，然后采用Western Blot方法检测细胞自噬标志物LC3水平的变化。3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生理性细胞自噬模型的建立方法，其特征在于：该自噬模型的建立方法包括以下步骤：用黄嘌呤氧化酶对培养中的动物细胞进行处理。
【技术特征摘要】
1.一种生理性细胞自噬模型的建立方法，其特征在于：该自噬模型的建立方法包括以下步骤：用黄嘌呤氧化酶对培养中的动物细胞进行处理。2.根据权利要求1所述一种生理性细胞自噬模型的建立方法，其特征在于：所述自噬模型的建立方法具体包括以下步骤：将动物细胞接种至培养器皿中并培养至动物细胞贴壁生长，然后向培养器皿中加入终浓度为1～40mU/mL的黄嘌呤氧化酶，并继续培养至少0.5小时。3.根据权利要求2所述一种生理性细胞自噬模型的建立方法，其特征在于：所述动物细胞接种量为1×104～3×105个。4.根据权利要求2所述一种生理性细胞自噬模型的建立方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦绪军，师腾瑞，海春旭，柏桦，刘瑞，
申请(专利权)人：秦绪军，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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