一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法技术

本发明专利技术公开了一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法。所述的联合培养方法包括以下步骤：(1)睾丸支持细胞的培养；(2)心肌组织收集、处理及消化，以获得心肌细胞；(3)采用双层培养法，用睾丸支持细胞联合培养心肌细胞，其中上层为睾丸支持细胞层，下层为心肌细胞；(4)分离、纯化培养的心肌细胞。本发明专利技术通过试验发现，用睾丸支持细胞联合培养心肌细胞，相比常规培养组，联合培养组细胞生长速度加快，细胞生长更加旺盛。联合培养组细胞铺满单层需要3‑4d，而常规培养组需要4‑5d。由此证明，睾丸支持细胞可有效促进心肌细胞生长。这种简单且低成本的心肌细胞培养方法，对心脏的生长、发育、生理、代谢、病理研究有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种心肌细胞培养方法，特别涉及一种心肌细胞和睾丸支持细胞的联合培养方法，属于细胞生物学和生物医学领域。
技术介绍
心肌细胞培养作为一种体外研究模型，可以更便捷的从细胞和分子水平对其生长、发育、生理、代谢、病理等进行研究，在许多研究领域有重要意义。随着社会经济的发展和生活水平的提高，人类的平均预期寿命显著延长，与之相对应的是，心脏疾病如冠心病的发病率也逐年升高。冠心病和心肌梗死所造成的心肌不可逆性损伤是严重威胁全世界健康的杀手。如何有效的让心肌再生是一个非常有价值的研究课题。有关心肌细胞的生物学属性，一直以来的观点认为，哺乳类心脏是终末分化器官，哺乳类动物成年后其心肌细胞永久性地退出细胞周期，不再具备增殖与再生的能力。哺乳动物的心肌细胞不能分裂的定论在近年来已被推翻。Kajstura等于1998年利用共聚焦显微镜研究心肌组织时，首次发现了正常的成熟心肌细胞具有分裂和增殖能力。在正常对照的心脏中，每100万个细胞中有14个细胞处于有丝分裂期，在缺血性心脏病患者的心脏中，处于有丝分裂的细胞数量大约增加了10倍左右，即100万细胞中有152个细胞处在有丝分裂阶段，原发性扩张性心脏病患者则为131个。同在1998年，An-vers和Kajstura也通过共聚焦显微镜发现了正常心肌组织中有处于有丝分裂期的细胞，并进行了其他一些相关实验，提出成年哺乳动物的心室肌细胞不是终末分化细胞的论点。随着分子生物学和细胞生物学的发展，细胞水平的研究日益受到重视。国内外诸多学者开展了心肌细胞的生理、病理、药理、代谢等方面的基础研究，体外培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点，并具有自发性节律搏动、不传代，且心肌细胞的培养具有不受体内神经体液因素的影响等特点。虽然，心肌细胞的培养在心脏生理、病理、药理、代谢等方面研究中已取得长足的发展，但心肌细胞培养娇贵，需要专门特质的心肌细胞培养基，且生长速度较慢等诸多培养瓶颈问题，阻碍了以心肌细胞作为模型细胞进行与心脏相关疾病的研究。因此，目前急需提出一种能够促进心肌细胞的生长，解决心肌细胞体外培养的诸多瓶颈问题的培养方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中的不足，本专利技术提出了一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法，该培养方法中，为了解决心肌细胞体外培养诸多瓶颈问题，巧妙的利用睾丸支持细胞作为“保姆”细胞，利用其自身自然分泌诸多生长因子，来促进心肌细胞的生长。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法，包括以下步骤：(1)睾丸支持细胞的培养；(2)心肌组织收集、处理及消化，以获得心肌细胞；(3)采用双层培养法，用睾丸支持细胞联合培养心肌细胞，其中上层为睾丸支持细胞层，下层为心肌细胞层；(4)分离、纯化培养的心肌细胞。在本专利技术中，优选的，步骤(1)中所述的睾丸支持细胞为羔羊睾丸支持细胞LSC，分类命名为羔羊睾丸支持细胞LSC，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C2016120，保藏时间为2016年6月3日。在本专利技术中，优选的，步骤(1)中所述的睾丸支持细胞为新生牛睾丸支持细胞系NBSC，分类命名为新生牛睾丸支持细胞系，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C201438，保藏时间为2014年3月28日。该细胞系已记载在申请号为201410161991.1，专利技术名称为“一种用于羊传染性脓疱病毒分离培养和增殖的细胞系及其制备方法和应用”的专利申请中。在本专利技术中，优选的，步骤(2)中所述的心肌细胞为原代心肌细胞或经纯化培养后的心肌细胞。在本专利技术中，优选的，步骤(2)中所述的心肌组织收集、处理及消化包括以下步骤：选取脱臼处死后的健康母鼠所生的1日龄豚鼠乳鼠，在无菌条件下，摘取心脏，剥离心包膜，小心剪取心室组织，用加双抗D-hanks洗涤心室组织2～3次，剔除纤维结缔组织，只留心肌组织，将心肌组织反复剪成长宽分别为1～3mm的小块，用混合酶消化法制备心肌细胞悬液。在本专利技术中，优选的，步骤(3)中所述的双层培养法包括以下步骤：利用双层培养皿培养心肌细胞，其中，睾丸支持细胞按细胞浓度1×105～5×105/ml培养在培养皿的上层，心肌细胞按细胞浓度1×105～5×105/ml培养在培养皿的下层；睾丸支持细胞与心肌细胞由孔径为0.4μm的聚碳酸酯膜隔开，上层的睾丸支持细胞贴壁生长在该膜上，置37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养3-5天。在生长过程中睾丸支持细胞分泌的各种生长因子可以分泌到培养皿下层的营养液中。这样心肌细胞可以有效的利用睾丸支持细胞分泌的生长因子，促进其生长。心肌细胞生长在培养皿底壁上。在本专利技术中，优选的，步骤(1)、(3)、(4)中培养细胞所用的培养液均为含有2～20％(v/v)胎牛血清的高糖DMEM培养液加，加青霉素、链霉素各100单位/ml，调pH至7.0～7.2。在本专利技术中，优选的，步骤(4)所述的分离、纯化培养心肌细胞包括以下步骤：在培养液中加0.1mM/L的5-嗅脱氧尿嘧啶，用差速贴壁法分离纯化位于培养皿下层的豚鼠心肌细胞。本专利技术通过试验发现，用睾丸支持细胞联合培养原代心肌细胞或纯化的心肌细胞过程中，可以用普通的细胞培养液—高糖DMEM代替CMM心肌细胞专用培养液，细胞生长良好；同时，相比常规培养组，无论是原代心肌细胞还是纯化的心肌细胞，联合培养组细胞生长速度加快，细胞生长更加旺盛。联合培养组细胞铺满单层需要3-4d，而常规培养组需要4-5d。由此证明，睾丸支持细胞与豚鼠心肌细胞联合培养，睾丸支持细胞分泌的细胞生长因子可有效促进心肌细胞生长。这种简单且低成本的心肌细胞培养方法，对心脏的生长、发育、生理、代谢、病理研究有重要的现实意义。附图说明图1为37℃、38.5℃和39.5℃条件下羔羊睾丸原代细胞体外生长曲线；图2为羔羊睾丸支持细胞及其自然传代细胞的体外培养；A：消化后培养0小时的支持细胞；B：培养2h的支持细胞；C：培养12h的支持细胞；D：培养72h的支持细胞；E：培养2h的自然传代细胞(LSC)；F：培养72h的自然传代细胞(LSC)；图3为羔羊睾丸支持细胞及其自然传代细胞的鉴定；A：分离纯化培养的第3代支持细胞HE染色；B：自然传代第10代LSC细胞HE染色；C：分离纯化培养的第3代支持细胞FasL蛋白检测；D：分离纯化培养的第三代支持细胞FasL蛋白检测结果；E：自然传代第10代LSC细胞FasL蛋白检测；F：自然传代第10代LSC细胞FasL蛋白检测结果；图4为原代心肌细胞联合培养试验组和对照组细胞生长特性；A：联合培养组培养12h后的原代心肌细胞；B：对照组培养12h后的原代心肌细胞；C：联合培养组培养72h后的原代心肌细胞；D：对照组培养72h后的原代心肌细胞；图5为原代心肌细胞的生长曲线；图6为纯化的心肌细胞生长曲线。A：培养24h后的纯化心肌细胞；B：培养96h后的纯化心肌细胞；C：纯化心肌细胞吉姆萨染色；D：纯化心肌细胞吉姆萨染色；E：纯化心肌细胞间接免疫荧光纯度检测；F：纯化心肌细胞间接免疫荧光Overlay；图7为纯化的心肌细胞的生长曲线。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法，其特征在于包括以下步骤：(1)睾丸支持细胞的培养；(2)心肌组织收集、处理及消化，以获得心肌细胞；(3)采用双层培养法，用睾丸支持细胞联合培养心肌细胞，其中上层为睾丸支持细胞层，下层为心肌细胞层；(4)分离、纯化培养的心肌细胞。

【技术特征摘要】
1.一种心肌细胞与睾丸支持细胞的联合培养方法，其特征在于包括以下步骤：(1)睾丸支持细胞的培养；(2)心肌组织收集、处理及消化，以获得心肌细胞；(3)采用双层培养法，用睾丸支持细胞联合培养心肌细胞，其中上层为睾丸支持细胞层，下层为心肌细胞层；(4)分离、纯化培养的心肌细胞。2.如权利要求1所述的联合培养方法，其特征在于步骤(1)中所述的睾丸支持细胞为羔羊睾丸支持细胞LSC，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：C2016120。3.如权利要求1所述的联合培养方法，其特征在于步骤(1)中所述的睾丸支持细胞为新生牛睾丸支持细胞系NBSC，该细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：C201438。4.如权利要求1所述的联合培养方法，其特征在于步骤(2)中所述的心肌细胞为原代心肌细胞或经纯化培养后的心肌细胞。5.如权利要求1所述的联合培养方法，其特征在于步骤(2)中所述的心肌组织收集、处理及消化包括以下步骤：选取脱臼处死后的健康母鼠所生的1日龄豚鼠乳鼠，在无菌条件下，摘取心脏，剥离心包膜，小心剪取心室组织，用加双抗D-...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚佑军，张志东，王光祥，刘湘涛，王艳华，吴锦艳，陈妍，张克山，田宏，尹双辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62