本发明专利技术公开一种检测胶基型烟草制品对人口腔细胞凋亡影响的方法，包括以下步骤：(1)将待测的所述胶基型烟草制品置于液氮中冷冻；(2)将冷冻的胶基型烟草制品立即用粉碎机将其粉碎；(3)再次将碎末胶基型烟草制品置于液氮中冷冻；(4)将碎末胶基型烟草制品用人工唾液浸泡；(5)将提取液离心分离；(6)用渗透压测定仪测定上层清液，调节其渗透压与细胞培养基一致；(7)测定提取液中的烟碱含量；(8)培养人口腔黏膜上皮细胞作为检测对象；(9)将胶基型烟草制品提取液加入到培养好的人口腔黏膜上皮细胞中；(10)经过不超过于24小时的培育后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术应用领域，尤其应用于胶基型烟草制品对于人口腔细胞凋亡影响的测定。
技术介绍
胶基型无烟气烟草制品(Tobacco chewing gum)是一种在胶基中加入了一定量的烟草提取物、香料以及其他一些食用添加剂制成的一种口用无烟气烟草制品。胶基型烟草制品的使用方式是放入口中咀嚼，咀嚼的溶出物会与唾液汇合聚集在口腔中，根据消费习惯的不同吐出或者咽下。由于该产品主要作用于口腔，直接与口腔细胞进行接触，因此有必要建立一种检测其对人口腔细胞凋亡影响的方法，以对其安全性进行评估。现有的烟草制品安全性评价方法主要是针对传统卷烟，通常是对传统卷烟的烟气进行捕集再进行后续的生物学测试。但是胶基型烟草制品并不产生烟气，且直接作用于口腔，因此传统卷烟的安全性评估方法并不适用于该产品。而袋装口含烟制品一般采用贴在牙龈与唇部之间的方式使用，其内含物采用普通浸泡法即可溶出，胶基型烟草制品由于胶基的存在，直接浸泡法大部分内含物难以溶出，从而无法准确进行生物安全性测试。
技术实现思路
本专利技术针对胶基型产品的特点，结合生物学检测方法，建立了一种检测胶基型烟草制品对人口腔细胞凋亡影响的方法，为胶基型烟草制品的安全性评估提供参考。本专利技术公开一种检测胶基型烟草制品对人口腔细胞凋亡影响的方法，包括以下步骤：(1)将待测的所述胶基型烟草制品置于液氮中冷冻20-40min；(2)将步骤(1)冷冻的所述胶基型烟草制品，立即用粉碎机将其粉碎，收集粉碎后的碎末胶基型烟草制品；(3)再次将所述碎末胶基型烟草制品置于液氮中冷冻；(4)将步骤(3)得到的所述碎末胶基型烟草制品用人工唾液浸泡20-40min，每隔2-5min搅动一次；所述人工唾液的温度为36-38℃；(5)将步骤(4)得到的提取液离心分离5-10min；(6)用渗透压测定仪测定步骤(5)得到的上层清液，调节其渗透压与细胞培养基一致，得到胶基型烟草制品提取液；(7)测定提取液中的烟碱含量；(8)培养人口腔黏膜上皮细胞作为检测对象；(9)将步骤(6)中获得的胶基型烟草制品提取液加入到步骤(8)中培养好的人口腔黏膜上皮细胞中；(10)经过不超过于24小时的短期培育后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。优选地，步骤(8)中的培养方法包括以下详细步骤：(8-1)口腔黏膜组织的提取：取6岁以下唇腭裂患者的口腔黏膜组织；(8-2)用含青霉素的浓度为100ug/mL、链霉素为50ug/mL的磷酸缓冲液冲洗步骤(8-1)的口腔黏膜组织2-3次；(8-3)组织块的剪切：用眼科剪去除(8-2)中的黏膜下组织，并将修剪后的黏膜剪成约5mm×5mm的小块，然后加入0.25％中性蛋白酶Ⅱ；(8-4)将步骤(8-3)的口腔黏膜小块在4℃下消化16-18h，然后将表层上皮与上皮下层分开；(8-5)上皮细胞的分离：将步骤(8-4)得到的上皮层，加人0.25％胰蛋白酶在36℃下消化15min，每5min吹打振动1次，然后加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打成单细胞悬液，离心分离，用磷酸缓冲液冲洗1-2次，然后加入到提前加入了生长因子的角质形成细胞培养基中；(8-6)上皮细胞的原代培养：将步骤(8-5)得到的上皮细胞制成单细胞悬液后用细胞计数，以1-2×105个/mL细胞的密度接种于25cm2培养瓶中，放入37℃，5％CO2培养箱中培养；3d后首次更换培养液，以后每2d更换培养液一次；(8-7)上皮细胞的传代培养：待步骤(8-6)的上皮细胞达到覆盖瓶底的80％时传代培养，用0.25％的胰蛋白酶消化，待上皮细胞变成圆形，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，离心分离，加入提前加入了生长因子的角质形成细胞培养基，使上皮细胞浓度达到5×105个/mL；将单细胞悬浮液种植到24孔细胞培养板中，接种量为500μL/孔，将种好的24孔细胞培养板放置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱内培养24h；优选地，步骤(10)中包括以下详细步骤：(10-1)受试物的孵育：将步骤(6)中获得的胶基型烟草制品提取液加入步骤(8-7)得到的上皮细胞中，以样品烟碱量作为检测剂量划分指标；空白对照组仅加入培养基，溶剂对照组加入人工唾液；(10-2)口腔黏膜上皮细胞消化：将步骤(10-1)中的上皮细胞与测试样品孵育24h后弃去培养液，用磷酸缓冲液洗涤2次，用0.25％胰酶消化细胞，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化后离心收集上皮细胞；(10-3)口腔黏膜上皮细胞染色：将(10-2)收集的上皮细胞重悬于Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡试剂盒中的染料结合液中，上皮细胞浓度约为5×105个/mL；取500μl的单细胞悬液，加入5μl AnnexinV-FITC混匀后，再加入5μL碘化丙啶，混匀；(10-4)将(10-3)中的上皮细胞与染料混合物室温避光反应10min后用流式细胞仪进行检测。本专利技术有益效果1、本专利技术考虑到胶基型烟草制品难以采用直接浸泡法进行提取的特点，采用超低温(约-196℃)冷冻后粉碎，这可以将胶基这种黏黏糊糊的物质有效粉碎成粉末，然后将粉末再次用液氮超低温冷冻后，快速加入到常温(36-38℃)人工唾液中，利用从深冷迅速到常温的这种骤热效应，促使粉末因急剧热胀冷缩而进一步破碎，提高粉末与提取液的接触面积，从而提高从粉末中萃取化学物质的效率。2、由于胶基型烟草制品通常为了增强口腔舒适感加入较多的糖分或者盐分等影响液体渗透压的物质，如果直接将提取液加入细胞中易导致由于渗透压的问题而引起细胞死亡，因此本专利技术在处理细胞之前调节了提取液的渗透压，从而提高实验的准确性。3、为了尽量模拟实际情况，本专利技术在提取时采用了人工唾液，并模拟了接近人口腔的温度和食用时间，在检测对象上选择了人口腔细胞，且为了尽量接近人口腔细胞的实际情况，本专利技术采用原代培养的方法培养了正常人口腔黏膜上皮细胞作为检测对象，相比较传统采用动物细胞或者癌细胞的检测，提高了试验的可靠性。4、本专利技术考虑到胶基型烟草制品对细胞影响的及时性，采用24h的短期孵育，同时采用流式细胞仪检测这种较为快速敏感的方法，能满足检测及时高效的要求。附图说明图1为不同浓度(浓度用尼古丁浓度标识，分别为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)的提取液处理人口腔细胞，测定提取液对人口腔黏膜上皮细胞凋亡的影响。具体实施方式1.随机挑选一种胶基型烟草制品(N-2，尼古丁含量2mg/颗)，随机挑选2颗放入样品管中，将样品管置于液氮中冷冻30min。2.将样品管从液氮中取出，再取出胶基型烟草制品(N-2)，立即用样品粉碎机将其粉碎，用样品管收集粉碎后的碎末。3.将装有胶基型烟草制品碎末的样品管再次置于液氮中冷冻30min；4.从液氮中取出样品管，立即加入10mL预热至37℃的人工唾液，浸泡粉碎后的胶基型烟草制品碎末(N-2)，采用37℃、30min的提取条件，并在浸泡过程中每隔2min搅动提取液以使样品与提取液充分接触从而利于内含物的溶出。5.将提取液置于15mL离心管中，离心10min以沉淀固体物。6.用移液器吸取上清置于新的离心管中，并使用渗透压测定仪测定提取液的渗透压，调节其渗透压与细胞培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测胶基型烟草制品对人口腔细胞凋亡影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测的所述胶基型烟草制品置于液氮中冷冻20‑40min；(2)将步骤(1)冷冻的所述胶基型烟草制品，立即用粉碎机将其粉碎，收集粉碎后的碎末胶基型烟草制品；(3)再次将所述碎末胶基型烟草制品置于液氮中冷冻；(4)将步骤(3)得到的所述碎末胶基型烟草制品用人工唾液浸泡20‑40min，每隔2‑5min搅动一次；所述人工唾液的温度为36‑38℃；(5)将步骤(4)得到的提取液离心分离5‑10min；(6)用渗透压测定仪测定步骤(5)得到的上层清液，调节其渗透压与细胞培养基一致，得到胶基型烟草制品提取液；(7)测定提取液中的烟碱含量；(8)培养人口腔黏膜上皮细胞作为检测对象；(9)将步骤(6)中获得的胶基型烟草制品提取液加入到步骤(8)中培养好的人口腔黏膜上皮细胞中；(10)经过不超过于24小时的培育后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
【技术特征摘要】
1.一种检测胶基型烟草制品对人口腔细胞凋亡影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测的所述胶基型烟草制品置于液氮中冷冻20-40min；(2)将步骤(1)冷冻的所述胶基型烟草制品，立即用粉碎机将其粉碎，收集粉碎后的碎末胶基型烟草制品；(3)再次将所述碎末胶基型烟草制品置于液氮中冷冻；(4)将步骤(3)得到的所述碎末胶基型烟草制品用人工唾液浸泡20-40min，每隔2-5min搅动一次；所述人工唾液的温度为36-38℃；(5)将步骤(4)得到的提取液离心分离5-10min；(6)用渗透压测定仪测定步骤(5)得到的上层清液，调节其渗透压与细胞培养基一致，得到胶基型烟草制品提取液；(7)测定提取液中的烟碱含量；(8)培养人口腔黏膜上皮细胞作为检测对象；(9)将步骤(6)中获得的胶基型烟草制品提取液加入到步骤(8)中培养好的人口腔黏膜上皮细胞中；(10)经过不超过于24小时的培育后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中的培养方法包括以下步骤：(8-1)口腔黏膜组织的提取：取6岁以下唇腭裂患者的口腔黏膜组织；(8-2)用含青霉素的浓度为100ug/mL、链霉素为50ug/mL的磷酸缓冲液冲洗步骤(8-1)的口腔黏膜组织2-3次；(8-3)组织块的剪切：用眼科剪去除(8-2)中的黏膜下组织，并将修剪后的黏膜剪成约5mm×5mm的小块，然后加入0.25％中性蛋白酶Ⅱ；(8-4)将步骤(8-3)的口腔黏膜小块在4℃下消化16-18h，然后将表层上皮与上皮下层分开；(8-5)上皮细胞的分离：将步骤(8-4)得到的上皮层，加人0.25％胰蛋白酶在36℃下消化15min，每5min吹打振动1次，然后加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打成单细胞悬液，离心分离，用磷酸缓冲液冲洗1-2次，...
【专利技术属性】
技术研发人员：高茜，夭建华，李雪梅，管莹，黄海涛，倪红梅，唐萍，朱洲海，米其利，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53
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