一种恶性腹水来源的TIL细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术涉及一种恶性腹水来源的TIL细胞的分离培养方法，利用PD‑1、LAG‑3和TIM‑3中的至少一种作为分离TIL细胞中肿瘤特异性T淋巴细胞的标记，并结合免疫磁珠技术将肿瘤特异性T淋巴细胞从TIL细胞群中分离出来，再经过体外高效扩增，获得高肿瘤杀伤活性的肿瘤特异性TIL细胞。本发明专利技术使肿瘤特异性TIL细胞的分离培养操作流程更简单，明显缩短分离培养时间，成本低，便于推广使用，另外分离得到的肿瘤特异性TIL细胞的肿瘤杀伤活性更强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞培养
，涉及恶性腹水来源的TIL细胞(肿瘤浸润淋巴细胞)的分离培养方法。
技术介绍
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是存在于肿瘤组织、肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中的淋巴细胞，相比于外周血淋巴细胞，TIL细胞中含有较高比例的活化的肿瘤特异性T淋巴细胞，这一类淋巴细胞经过体外分离、扩增、活化后，对肿瘤细胞的杀伤活性提高，可用于肿瘤的过继细胞免疫治疗。使用这种技术已经取得了良好的临床效果。Rosenberg等采用全身放疗+化疗+TIL细胞治疗恶性黑色素瘤，总有效率达到了72％(Rosenberg SA1,Dudley ME.Adoptive Cell Therapy for the Treatment of Patients with Metastatic Melanoma.Curr Opin Immunol.2009Apr；21(2):233-240.)；Li J等采用化放疗+TIL细胞治疗鼻咽癌，20人中有19人有客观的抗肿瘤反应(Li J1,Chen QY2,He J1,Li ZL1,Tang XF1,Chen SP1,Xie CM3,Li YQ1,Huang LX1,Ye SB1,Ke M1,Tang LQ2,Liu H2,Zhang L2,Guo SS2,Xia JC1,Zhang XS1,Zheng LM1,Guo X2,Qian CN2,Mai HQ2,Zeng YX4.Phase I trial of adoptively transferred tumor-infiltrating lymphocyte immunotherapy following concurrent chemoradiotherapy in patients with locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma.Oncoimmunology.2015Mar 6；4(2):e976507.eCollection 2015.)；Khammari A等用TIL细胞结合瘤内注射表达IFN-r的腺病毒治疗恶心黑色素瘤，取得了46％的疾病控制率(Khammari A1,Nguyen JM,Saint-Jean M,Knol AC,Pandolfino MC,Quereux G,Brocard A,Peuvrel L,Saiagh S,Bataille V,Limacher JM,Dreno B.Adoptive T cell therapy combined with intralesional administrations of TG1042(adenovirus expressing interferon-γ)in metastatic melanoma patients.Cancer Immunol Immunother.2015Apr 7.)。目前临床应用的TIL细胞的来源主要有两个方面：1.手术切除的肿瘤组织或淋巴结；2.癌性胸腹水。从手术样品中分离TIL细胞一般需要经过机械剪切，多种蛋白酶的酶解等多个步骤；癌性胸腹水来源的TIL细胞分离的方法相对简单，也容易在体外培养。由于TIL细胞是一种异质性的细胞群，包含T细胞、B细胞、NK细胞等，其中发挥抗肿瘤作用的主要是活化的肿瘤特异性T淋巴细胞，因此TIL细胞治疗的关键技术是如何从TIL中筛选出活化的肿瘤特异性T淋巴细胞并进行扩增培养。传统的TIL细胞分离和培养步骤复杂，整个操作时间将近2个月，其中分离和鉴定肿瘤特异性TIL细胞的过程最复杂、耗时最长。首先需要将肿瘤组织制作成小块组织或单细胞悬液，分成很多小份然后用大剂量IL-2培养，培养4-6个星期后，每份取少量细胞与肿瘤细胞进行共培养，通过测试共培养后的上清中IFN-r的含量确定哪一份里面有肿瘤特异性T淋巴细胞。然后取这些孔内的细胞进行快速扩增培养。这种操作方法步骤复杂，时间长，而且分离过程易受操作者主观因素的影响，不同的操作者操作的结果差别很大。长时间的操作过程容易导致污染，且细胞活力降低。因此很大程度地影响了TIL细胞临床应用的效果。因此TIL治疗的两大关键的技术，一是要从恶性腹水中找到肿瘤抗原特异性的T淋巴细胞，并把它分离出来；二是要把这些珍贵的T淋巴细胞进行大量扩增。要把具有肿瘤特异性杀伤活性的肿瘤特异性T淋巴细胞从肿瘤组织中分离出来，需要用到一个可以区分肿瘤特异性T淋巴细胞的表面标记。肿瘤组织中的肿瘤抗原特异性T淋巴细胞是一种已经活化了的T淋巴细胞，PD-1、LAG-3和TIM-3都是T细胞活化后诱导表达的抑制性受体，与其配体结合后抑制T细胞的活化和功能。TIL细胞中具有肿瘤特异性杀伤活性的T淋巴细胞就存在于这一群已经活化了的T淋巴细胞中(Alena Gros etc.PD-1identifies the patient-specific CD8+tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.The Journal of Clinical Investigation.Volume 124Number 5May 2014)。因此PD-1、LAG-3和TIM-3都可以作为分离TIL细胞中肿瘤特异性T淋巴细胞的标记。免疫磁珠(Immunomagnetic bead,IMB)技术是一种免疫学技术，IMB为包被有抗体的球型磁性微粒，可特异性地与靶物质结合使之具有磁响应性。IMB技术的优势在于可以保证被分离靶细胞的形态和功能完整，同时还具有灵敏度高、特异性高、检测速度快、重复性好、操作简单和不需要昂贵的仪器设备等优点。用IMB技术进行细胞分离由两种方式，一种是直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法称为阳性分离；用IMB去除无关细胞使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离。因此利用免疫磁珠将具有肿瘤特异性杀伤活性的肿瘤特异性T淋巴细胞从TIL细胞群中直接分离出来。目前未有文献报道利用PD-1、LAG-3和TIM-3中的至少一种作为分离TIL细胞中肿瘤特异性T淋巴细胞的标记，并结合免疫磁珠技术将肿瘤特异性T淋巴细胞从TIL细胞群中分离出来，再经过体外高效扩增获得肿瘤特异性TIL细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术分离培养TIL细胞操作复杂、耗时、长时间的操作过程容易导致污染、细胞活力降低的不足，提供了一种TIL细胞的分离培养方法，该方法将具有肿瘤特异性杀伤活性的肿瘤特异性T淋巴细胞从TIL细胞群中分离出来并进行大量扩增培养，操作流程更简单，花费时间明显缩短，便于推广使用，分离得到的肿瘤特异性TIL细胞杀伤活性更强。本专利技术的技术方案是：步骤一，单细胞悬液的制备，即从恶性腹水中获取含有肿瘤特异性T淋巴细胞的单细胞悬液；步骤二：使用免疫磁珠技术将所述单细胞悬液进行分离，即将肿瘤特异性T淋巴细胞从肿瘤细胞、肿瘤非特异性T淋巴细胞、抑制性T淋巴细胞、成纤维细胞等混合体中分离出来，得到肿瘤特异性TIL细胞；步骤三：肿瘤特异性TIL细胞的快速扩增，即将所述肿瘤特异性TIL细胞在高效扩增培养体系中进行高效扩增培养，得到大量的具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性TIL细胞。优选的，步骤一中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤一，肿瘤组织单细胞悬液的制备，即从恶性腹水中获取含有肿瘤特异性T淋巴细胞的单细胞悬液；步骤二：使用免疫磁珠技术将所述单细胞悬液进行分离，得到肿瘤特异性TIL细胞；步骤三：肿瘤特异性TIL细胞的快速扩增，即将所述肿瘤特异性TIL细胞在高效扩增培养体系中进行高效扩增培养，得到大量的具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性TIL细胞。

【技术特征摘要】
1.肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤一，肿瘤组织单细胞悬液的制备，即从恶性腹水中获取含有肿瘤特异性T淋巴细胞的单细胞悬液；步骤二：使用免疫磁珠技术将所述单细胞悬液进行分离，得到肿瘤特异性TIL细胞；步骤三：肿瘤特异性TIL细胞的快速扩增，即将所述肿瘤特异性TIL细胞在高效扩增培养体系中进行高效扩增培养，得到大量的具有特异性杀伤肿瘤细胞活性的肿瘤特异性TIL细胞。2.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤一中，所述肿瘤组织单细胞悬液的制备，具体包括如下步骤：恶性腹水用D-Hanks平衡盐溶液洗涤，用Ficoll密度梯度法分离单个核细胞，得到肿瘤组织单细胞悬液。3.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤二中，所述使用免疫磁珠技术将所述单细胞悬液进行分离，具体包括如下步骤：(c)往步骤一所得肿瘤组织单细胞悬液中加入PBS缓冲溶液、抗体溶液、Fc受体阻断剂、磁珠，混匀，重悬得细胞悬液。(d)将所述细胞悬液加入到细胞分选柱中，利用磁性分离器收集肿瘤特异性TIL细胞。4.如权利要求1所述的肿瘤特异性TIL细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤三中，所述肿瘤特异性TIL细胞的快速扩增，具体包括如下步骤：(e)将步骤二得到的肿瘤特异性TIL细胞与下列试剂和因子混合培养：CM和AIM-V混合培养基，异体辐射致死(50Gy)的PBMC，OKT3抗体。(f)第2天加入IL-2；(g)根据细胞数进行扩瓶(袋)培养，培养基为...

【专利技术属性】
技术研发人员：武宁，谢志明，
申请(专利权)人：英普乐孚生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31