一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用，本发明专利技术在体外环境中将永生化的单核细胞(以U937单核细胞系为例)在PMA和IL‑4、IL‑10、TGFβ生长因子刺激下诱导为肿瘤相关巨噬细胞，并以此为基础，采用肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞体内外共培养方法，研究肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤演进中的生物学功能及靶向治疗价值，为肿瘤免疫基础研究和基于肿瘤免疫巨噬细胞的治疗手段的研发提供重要工具和实验手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物细胞系领域，特别涉及一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用。
技术介绍
肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated Macrophages)是肿瘤微环境中一类单核巨噬细胞来源特殊炎症细胞，广泛存在于胶质瘤、乳腺癌等各类实体肿瘤组织中。作为肿瘤相关炎症的主要参与者，肿瘤相关巨噬细胞能调控增殖、侵袭、血管生成等恶性生物学行为并产生免疫抑制，对肿瘤的发生发展产生重要影响。根据其特殊膜表面标记物的表达及肿瘤免疫学功能，肿瘤相关巨噬细胞可分为M1和M2两个亚型。M1型肿瘤相关巨噬细胞高表达iNOS、MHCII、CD80等膜表面分子，通过直接吞噬或分泌肿瘤抑制性细胞因子，发挥免疫监视、肿瘤杀伤的作用；M2型肿瘤相关巨噬细胞高表达CD163、Fizz1、Arg1、CD206等膜表面分子，通过旁分泌肿瘤细胞所需的生长因子或趋化因子，发挥促进肿瘤细胞免疫逃避、维持肿瘤生长及侵袭转移的作用。此外，肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞间常存在密切的相互作用，例如，胶质瘤细胞可通过分泌POSTN(Periostin,Osteoblast Specific Factor)募集外周循环系统的单核细胞并促进其分化为肿瘤相关巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞则通过旁分泌途径，促进胶质瘤细胞的“干性”维持和肿瘤生长。鉴于M2型肿瘤相关巨噬细胞在促进肿瘤恶性生物学行为及肿瘤演进重要功能，以M2型肿瘤相关巨噬细胞作为免疫治疗靶点，或成为治疗胶质瘤、乳腺癌等多种实体肿瘤的新策略。由于肿瘤相关巨噬细胞的维持依赖肿瘤体内微环境，难以分离培养，目前尚缺乏针对肿瘤相关巨噬细胞的理想的细胞实验模型。鉴于肿瘤相关巨噬细胞多来源于血液中的单核巨噬细胞，探索体外条件下将单核细胞诱导为肿瘤相关巨噬细胞的新方法，或为肿瘤相关巨噬细胞的基础研究与临床应用提供有效的解决途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的构建方法及应用，本专利技术在体外环境中将永生化的单核细胞(以U937单核细胞系为例)在PMA和IL-4、IL-10、TGFβ生长因子刺激下诱导为肿瘤相关巨噬细胞，并以此为基础，采用肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞体内外共培养方法，研究肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤演进中的生物学功能及靶向治疗价值，为肿瘤免疫基础研究和基于肿瘤免疫巨噬细胞的治疗手段的研发提供重要工具和实验手段。本专利技术的技术方案是：一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型，该细胞模型为将人单核淋巴细胞系U937(U937单核细胞)经活化和生长因子刺激诱导而成。所述活化采用PMA活化。所述生长因子刺激为IL-4、IL-10和TGF-β序贯刺激。一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的建立方法，有以下步骤：1)PMA活化U937单核细胞，得到U937源性巨噬细胞；2)步骤1)所述的U937源性巨噬细胞，经生长因子刺激后，分选，得到U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞。步骤1)所述活化，其PMA为5nM，活化时间为48小时。步骤2)所述生长因子刺激是IL-4、IL-10和TGF-β生长因子序贯刺激，时间为72小时，所述分选采用CD163抗体流式分选CD163+细胞。上述M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在研究M2型肿瘤相关巨噬细胞的基因特征和肿瘤演进中的生物学功能的应用。上述M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在研究M2型肿瘤相关巨噬细胞与各类肿瘤细胞的相互作用及机制中的应用。上述M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在研究M2型肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤成瘤的影响及衍生的药物靶向治疗的应用。上述M2型肿瘤相关巨噬细胞模型在促进胶质瘤生长的应用。为了检测本专利中构建的U937源性肿瘤相关巨噬细胞的生物学功能及应用价值，申请人采用免疫缺陷小鼠在体原位移植瘤模型(以胶质瘤为例，临床胶质瘤样本中富含肿瘤相关巨噬细胞，且对胶质瘤生长十分关键)，将U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞共注射，观察U937、THP1来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞对胶质瘤生长和荷瘤鼠生存时间的影响，模拟M2型肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤细胞生长的体内环境。其有益效果是：1.成功在体外条件下将U937来源的单核细胞诱导为M2型巨噬细胞并鉴定其标记物表达和基因型本专利技术采用PMA诱导活化和IL-4、IL-10、TGFβ三种生长因子的联合刺激，使U937来源的单核细胞诱导为M2型肿瘤相关巨噬细胞。申请人经实验验证：PCR检测结果表明，诱导后的M2型肿瘤相关巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞标记物CD163、Fizz1、Arg1、CD206，低表达M1巨噬细胞标记物iNOS、MHC-II；免疫荧光染色鉴定结果表明，诱导后的M2型肿瘤相关巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞标记物CD163。短串联重复序列(Short tandem repeat,STR)测序比对结果提示，M2型肿瘤相关巨噬细胞与U937单核细胞具有一致的基因表型，表明M2型肿瘤相关巨噬细胞来源于U937细胞，且在模型建立过程中未发生基因变异。2.U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞模拟M2型肿瘤相关巨噬细胞促肿瘤细胞生长的体内环境。采用免疫缺陷小鼠在体原位移植瘤模型，发现U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞共注射，促进肿瘤细胞生长并显著缩短荷瘤鼠生存期。3.通过短串联重复序列(Short tandem repeat,STR)测序比对，明确M2型肿瘤相关巨噬细胞与U937单核细胞具有一致的基因表型，表明M2型肿瘤相关巨噬细胞来源于U937细胞，且在模型建立过程中未发生基因变异。本专利技术利用U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞模拟M2型肿瘤相关巨噬细胞促肿瘤细胞生长的体内环境，结果将为研究肿瘤相关巨噬细胞的功能和研发基于肿瘤免疫巨噬细胞的治疗手段提供重要工具和实验手段。附图说明图1为U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞的诱导、分选；图2为qRT-PCR鉴定U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞中M1、M2型巨噬细胞标记物的表达；图3为免疫荧光鉴定U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞中M2型巨噬细胞标记物CD163的表达，图中，A为免疫荧光典型图像；标尺＝25ul，B为CD163+细胞的定量结果；图4为U937来源的M2型肿瘤相关巨噬细胞的STR分型图谱；图5为M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞共注射的颅内原位移植瘤模型，图中，A为共注射模型构建的流程图，B为IVIS活体动物成像检测M2型肿瘤相关巨噬细胞促肿瘤生长的效果，C为M2型肿瘤相关巨噬细胞与胶质瘤细胞共注射对荷瘤鼠生存期的影响。具体实施方式以下将参照附图，对本专利技术的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本专利技术的内容进行说明，但并不是本专利技术的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本专利技术的保护范围。试剂、仪器和来源青/链霉素混合液美国Gibco公司RPMI-1640培养基美国Sigma公司NaHCO3美国Sigma公司HEPES美国Sigma公司胎牛血清(FBS)美国Gibco公司0.22μm微孔滤膜美国BD公司PMA美国Sigma公司IL-4、IL-10和TGF1生长因子美国Peprotech公司牛血清白蛋白(BSA)美本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型，其特征在于：该细胞模型为将人单核淋巴细胞系U937(U937单核细胞)经活化和生长因子刺激诱导而成。

【技术特征摘要】
1.一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型，其特征在于：该细胞模型为将人单核淋巴细胞系U937(U937单核细胞)经活化和生长因子刺激诱导而成。2.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于：所述活化采用PMA活化。3.根据权利要求1所述的细胞模型，其特征在于：所述生长因子刺激为IL-4、IL-10和TGF-β序贯刺激。4.一种M2型肿瘤相关巨噬细胞模型的建立方法，其特征在于，有以下步骤：1)PMA活化U937单核细胞，得到U937源性巨噬细胞；2)步骤1)所述的U937源性巨噬细胞，经生长因子刺激后，分选，得到U937源性M2型肿瘤相关巨噬细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)所述活化，其PMA为5nM，活化时间为48小时...

【专利技术属性】
技术研发人员：时雨，平轶芳，曹棉富，张厦，卞修武，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50