本发明专利技术属于生物化学技术领域，涉及汇诺肽制品生物效价含量的高效液相色谱（HPLC）检测方法。在汇诺肽制剂稀释处理前，预先加入有机溶剂和缓冲液的混合溶液进行提取；采用带紫外可见分光检测器的高效液相色谱仪，乙腈∶水相＝50：50 的流动相；0.5mL/min~2.0mL/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱；230nm‑250nm的检测波长；将各个副峰的面积以面积折算系数(K)对其折算后，再用处理主峰的方法处理结果，将HPLC 测定结果通过含量矫正系数(P)的平均值换算获得生物效价含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学
，涉及一种饲料药物添加剂汇诺肽及其各种制品的含量检验方法，具体涉及汇诺肽各种制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法。
技术介绍
汇诺肽是一种多肽类的化合物，最早由浙江汇能生物股份有限公司以那西肽为原料，通过一定化学反应得到，CAS号为1887057-00-2。该物质对革兰氏阳性菌有较强效果，对革兰氏阴性菌有一定的效果，抗球虫效果较好，并具有一定抗病毒效果，适用范围广，安全性高，可广泛用于经济动物的饲养中。纯品汇诺肽是一种黄褐色粉末，属脂溶性物质，其分子量为1153，分子式为C48H39N11O12S6，分子结构参见下式。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的上述问题，采用快速直观的HPLC测定方法，通过特殊处理，将汇诺肽制品含量结果能直接表达为生物效价含量。本专利技术包括如下内容：汇诺肽制品生物效价含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法，包括待测样品的预处理，指定的色谱条件，测定图谱的处理分析等：(1)用对汇诺肽有相当脂溶性的有机溶剂和缓冲液的混合溶液对其制剂进行提取，以便能完全提取汇诺肽，从而获得HPLC测定所需的待测液；(2)指定的色谱条件为：带紫外可见分光检测器的高效液相色谱仪，乙腈：水相＝50：50的流动相；0.5mL/min～2.0mL/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱；230nm-250nm的检测波长；(3)将测定图谱的各个副峰的面积以面积折算系数(K)对其折算后，再用处理主峰的方法处理结果，该面积折算系数(K)为：1/2～3/4；(4)将HPLC测定结果通过含量矫正系数(P)的平均值换算获得生物效价含量，含量矫正系数(P)为0.970～1.050。本专利技术所述的提取用的混合溶液中的有机溶剂是指N，N-二甲基甲酰胺(N，N-dimethylformamide DMF)，缓冲液是指磷酸-磷酸盐缓冲液。以上(2)的所述水相为≤0.50％重量百分比的磷酸水溶液。本专利技术的有益效果为：1.本专利技术提供了采用有机溶剂与缓冲液的混合溶液高效提取汇诺肽，以获得待测样提取液的预处理方法。该处理液可用于汇诺肽制品含量测定或用于其它非测定目的。2.本专利技术提供了在指定的HPLC条件下测定汇诺肽制品主成分及相关其它成分含量的方法，该方法快速实用、干扰少、测定结果重复性好，是一个有效可靠的新颖测定方法。3.本专利技术用HPLC测定结果在处理后可直接代表汇诺肽制品生物效价含量的方法，以及在对测定结果进行处理时采用有效而可靠的计算方法。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。本专利技术涉及的汇诺肽样品由浙江汇能生物股份有限公司提供，其他所涉及的实验用试剂均采购于浙江医药试剂股份有限公司。以本专利技术涉及的检测仪器、条件、方法步骤如下：①、检验设备条件：高效液相色谱仪(带紫外可见分光检测器)流动相：乙氰：水相(≤0.50％重量百分比的磷酸水溶液)＝50：50；流速：0.5mL/min-2.0mL/mim。检测柱：反相碳十八大分子填充柱。检测波长：230nm-250nm。②、供试液预处理：标准贮备液：精密称定已知汇诺肽制品含量(或已知相当的生物效价的)的标准品于适宜的容量瓶中，加入20mL的DMF液超声至彻底溶解，用DMF液稀释到容量瓶满刻度，将其制备成1000ppm的贮备液。避光低温保存，其有效期为三个月。标准供试液：上述标准贮备液恢复至室温后，准确移取预先计算所需的体积数，并置于适宜的容量瓶中，加入10mL的DMF，混均匀后用甲醇液稀释到容量瓶满刻度，将其制备成50ppm的供试液，或配制成稀释系列液。用微过滤膜滤过，以备HPLC检验测定用。该液应临用时配制，并尽可能避光。待检样供试液：精密称定预先计算制备50ppm浓度所需要的待检样品的相当质量，置于适宜体积的容量瓶中，加入40mL的DMF液，及10mL的磷酸磷酸盐缓冲液，将样品充分润湿。室温下用超声或用振摇法提取，完成后用DMF液稀释到容量瓶满刻度，而将其制备成约50ppm的待检样供试液。用微过滤膜滤过，供HPLC检验测定用。该液应临用时配制，并尽可能避光。为保证置信度，同一批号样应进行三个或以上的同等处理平行样。③、样品HPLC测定：打开HPLC仪器，按照本专利技术①指定的检验条件进行设定，预运行仪器以获得平稳的基线。用微量注射进样器对标准供试液和待检样供试液操作进样，每个样液每次进样20μL，以获得相应的色谱谱图。④、测定结果的计算方法：以峰面积外标工作曲线法或以单点峰面积外标法进行处理计算。⑤、不同时间出峰组分在测定结果计算中的处理原则：在处理主峰汇诺肽峰时，可直接用标准汇诺肽峰的峰面积外标法(工作曲线法或以单点计算法)进行比对计算，以求得待检样中汇诺肽的含量。⑥、在得到汇诺肽的HPLC结果后，可以直接采用含量矫正系数(P)来计算得出其生物效价含量表达值。对本专利技术方案的可行性分析如下：1、待检样供试液对样品中待测定成分的代表性研究：本专利技术中使用的用混合液高效提取处理待测样的方法是通过以下研究获得的。研究理论表明：不论采用什么方法进行含量测定，样品的前处理是十分重要的，要求是前处理获得的待检样供试液必须能稳定地代表样品的待测成分的真实含量值。即处理液的回收率较大(≥95％)且能保持一定的稳定性(RSD，CV≤2％)时，该方法才会是一个可靠的定量检验方法。由于汇诺肽的大分子结构决定了其对提取条件有相当的敏感性，影响汇诺肽高效稳定地被提取的因素有很多，如温度、时间、pH、溶剂类型等，均会对其溶出度或者在溶出后的稳定性产生影响。前处理过程或条件控制得不好，极易造成提取不完全或形成降解。我们用不同实际含量的预混剂，按不同条件进行提取比较操作，并进行统计分析。通过影响因素的效率统计研究表明：前处理条件的不同会导致完全不同的提取液浓度情况，从而导致最终的检测结果不同。只有使用了适宜的处理条件，才能获得较高的回收值。实验证明：①、采用有机溶剂和缓冲溶液的混合溶液进行处理，才能达到有效率地提取。②、不同的有机溶剂对脂溶性汇诺肽进行提取的效果不同。③、采用合适的有机溶剂(DMF)与适宜的缓冲液混合提取汇诺肽，才可以获得最高的提取值和最稳定的提取效率。数据研究表明：该提取方法获得的待检样供试液的平均回收率值达到102.6％，满足90％-110％的方法要求；此平均回收率的CV(％)为0.6％，明显小于2％的方法理论规定。2、本专利技术测试方法可靠性研究：本专利技术中使用的方法条件组合是通过以下研究获得的。方法研究理论表明：检测方法的可行性和可靠性是决定检测结果的关键。因此需要对其进行科学的评价，下面通过方法精密度、准确度、线性范围对液相色谱测定方法进行验证：①、精密度：方法精密度是指分析结果的重复性或重现性。对于一个实用的定量方法，其重复性的精密度(既变异系数CV％，RSD％)必须控制在尽可能小的范围内，考虑到方法本身和操作因素外精密度大小还与待测物浓度有关，而一般指标是若浓度在≥100mg/kg时，我们用理论含量为0.5％的某批号制剂样品进行平行性实验，共检测40个平行样。测试研究数据证明表明在本专利技术条件下检测获得的样品测试结果的CV(％)＝0.539％，明显小于5％的要求，说明该方法的重复测试精本文档来自技高网...
【技术保护点】
汇诺肽制品生物效价含量的高效液相色谱 (HPLC) 检测方法，包括待测样品的预处理，指定的色谱条件，测定图谱的处理分析，其特征在于：(1) 用对汇诺肽有相当脂溶性的有机溶剂和缓冲液的混合溶液对其制剂进行提取，获得汇诺肽HPLC待测液；所述对汇诺肽有相当脂溶性的有机溶剂是指 N，N‑二甲基甲酰胺，混合的缓冲液是指磷酸‑磷酸盐缓冲液；(2) 指定的色谱条件为：带紫外可见分光检测器的高效液相色谱仪，乙腈：水相＝50：50的流动相；0.5mL/min~2.0mL/mim的流速；反相碳十八大分子填充柱；230nm‑250nm的检测波长；所述水相为≤ 0.50％重量百分比的磷酸水溶液 ；(3) 将测定图谱各个副峰的面积以面积折算系数(K)对其折算后，再用处理主峰的方法处理结果，该面积折算系数(K)为：1/2~3/4；(4) 将HPLC测定结果通过含量矫正系数(P)的平均值换算获得生物效价含量，含量矫正系数(P)为0.970~1.050；(5) 上述待测样品为汇诺肽的发酵原液或其各种制剂。
【技术特征摘要】
1.汇诺肽制品生物效价含量的高效液相色谱 (HPLC) 检测方法，包括待测样品的预处理，指定的色谱条件，测定图谱的处理分析，其特征在于：(1) 用对汇诺肽有相当脂溶性的有机溶剂和缓冲液的混合溶液对其制剂进行提取，获得汇诺肽HPLC待测液；所述对汇诺肽有相当脂溶性的有机溶剂是指 N，N-二甲基甲酰胺，混合的缓冲液是指磷酸-磷酸盐缓冲液；(2) 指定的色谱条件为：带紫外可见分光检测器的高效液相色谱仪，乙腈：水相＝50：50的流动相；0.5mL/mi...
【专利技术属性】
技术研发人员：闻鸣，徐天华，吴中华，何奇雷，
申请(专利权)人：浙江汇能生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。