一种改进的Fmoc多肽固相合成缩宫素的方法技术

本发明专利技术公开了一种改进的Fmoc多肽固相合成缩宫素的方法。该方法包括以下步骤：1）以Rink Amide AM树脂为固相载体，以Fmoc保护氨基酸为单体，N末端为Boc‑Cys(Acm)‑OH，哌嗪溶液为脱帽试剂，在缩合剂和碱性条件作用下，依次逐个接上氨基酸，合成缩宫素；2）用碘脱去Acm同时在固相载体上形成二硫键，得到环化保护缩宫素序列；3）进行切肽，浓缩，得到缩宫素的粗品；4）将粗品提纯后，得到缩宫素产品。本发明专利技术提供了一种合成效率高、成本较低、环境友好、反应条件温和、纯度和效价高，有利于工业化生产的缩宫素合成工艺。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种改进的Fmoc多肽固相合成缩宫素的方法。
技术介绍
缩宫素，也叫催产素，英文名oxytocin，分子式C43H66N12O12S2，分子量为1007.2，化学结构式如下：缩宫素主要分布在人和哺乳动物的下丘脑垂体后叶。随着对其研究的逐渐深入，除了缩宫素常见的收缩子宫、泌乳等作用外，人们发现缩宫素还有许多复杂的生理功能，如参与学习、记忆过程、影响药物成瘾性及对社会适应性行为、母性行为、性行为、摄食、痛觉调节以及心血管、体温的调节等。目前国内的缩宫素原料药基本上都是生物提取的乙酸溶液，效价仅有160IU/ml，生物提取的产品安全性难以保证，加压素等难以纯化除去。目前缩宫素的液相合成法都用到了剧烈、不安全的反应条件(如氨钠法)，反应步骤多，产率低，不适合大量生产；国内外报道的缩宫素固相合成法均用价格较高的哌啶作为脱帽试剂，哌啶是一种无色液体，不易运输和储存，长期储存容易变质，作为易制毒试剂，对企业的物料管理带来极大不便；二硫键的形成方法均是用空气或双氧水进行环化反应，反应时间长，容易产生多聚物，产率和纯度低，难以满足市场需求。1953年，du Vigneaud,Vincent在液相中首次合成了缩宫素(见文献：V.d.Vigneaud,C.Ressler,C.J.M.Swan,C.W.Roberts,P.G.Katsoyannis and S.Gordon,Journal of the American Chemical Society 1953,75,4879-4880)，并证实了其生物活性；他们合成了三个片段：Cbz-Cys(Bzl)-Tyr,Tosyl-Ile-Gln-Asn,Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2，依次组装合成了保护缩宫素序列：Cbz-Cys(Bzl)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2；在后来改进的方法中(见文献：M.Bodanszky and V.du Vigneaud,Journal of the American Chemical Society 1959,81,2504-2507)，du Vigneaud,Vincent等合成了Cbz-Cys(Bzl)-Tyr,Ile-Gln-Asn和Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2，然后，Cbz-Cys(Bzl)-Tyr和Ile-Gln-Asn用氯甲酸异丁酯法合成Cbz-Cys(Bzl)-Tyr-Ile-Gln-Asn，接着用DCC法和氯甲酸异丁酯法合成九肽Cbz-Cys(Bzl)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2。这些方法最终均用金属钠/液氨的条件脱去保护基，并采用空气氧化法形成二硫键，得到的缩宫素粗肽，纯化后其效价均低于500IU/mg，这些反应步骤复杂，金属钠/液氨的反应条件危险，环化反应时间长，总收率低，不能满足生产需要。目前国内缩宫素的合成方法主要有液相法和固相法。其中，专利CN101914136A公布了一种液相合成缩宫素的方法，该方法用金属钠/液氨的方法脱去保护基，然后用空气氧化法形成二硫键；专利CN101235081A公布了一种液相合成缩宫素的方法，该方法片段缩合时间达10-40小时，用空气作为氧化剂形成二硫键；专利CN1990501A公布了一种固相合成缩宫素的方法，该方法使用哌啶作为脱帽试剂，将肽链从树脂上切割下来后，用空气或双氧水进行氧化，Fmoc-Cys(Trt)-OH作为单体形成二硫键；专利CN102850441A公布了一种固相合成缩宫素的方法，该方法与专利CN1990501A类似。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种改进的Fmoc多肽固相合成缩宫素的方法。本专利技术的技术方案如下：一种改进的Fmoc多肽固相合成缩宫素的方法，包括以下步骤：1)以Rink Amide AM树脂为固相载体，以Fmoc保护氨基酸为单体，N末端为Boc-Cys(Acm)-OH，哌嗪溶液为脱帽试剂，在缩合剂和碱性条件作用下，依次逐个接上氨基酸，合成缩宫素；2)用碘脱去Acm同时在固相载体上形成二硫键，得到环化保护缩宫素序列；3)进行切肽，浓缩，得到缩宫素的粗品；4)将粗品提纯后，得到缩宫素产品。所述的缩宫素氨基酸序列为步骤1)中，所述的Rink Amide AM树脂的取代率为0.55mmol/g。步骤1)中，保护的氨基酸单体为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Boc-Cys(Acm)-OH。步骤1)中，所述的哌嗪溶液的溶剂为偶极非质子溶剂。步骤1)中，所述的缩合剂为HATU、HBTU、TATU、TBTU中的其中一种。步骤1)中，所述的碱为有机碱。步骤2)中，所述的碘为单质碘。步骤3)中，所述的切肽试剂为TIS的三氟乙酸溶液。步骤4)中，所述的缩宫素产品，其生物活性大于550IU/mg。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种合成效率高、成本较低、环境友好、反应条件温和、纯度和效价高，有利于工业化生产的缩宫素合成工艺。具体如下：本专利技术首次使用哌嗪作为脱帽试剂合成缩宫素；首次在所有活性基团全保护的条件下直接用碘进行固相环化；首次使用N-Boc保护的Acm半胱胺酸作为缩宫素的N末端氨基酸的合成单元，得到高纯度(粗品纯度达90％)和高效价的缩宫素产品(590IU/mg)。附图说明图1是Fmoc-Leu-OH的标准曲线；图2是四肽(H-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2)HPLC图谱；图3是五肽(H-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2)HPLC图谱；图4是六肽(H-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2)HPLC图谱；图5是七肽(H-Ile-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2)HPLC图谱；图6是八肽(H-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2)HPLC图谱；图7是化合物一(九肽:H-Cys(Acm)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2)HPLC图谱；图8是化合物一(九肽:H-Cys(Acm)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2)ESI-MS图谱；图9是化合物二(相关杂质a:H-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2)的的HPLC图；图10是化合物二(相关杂质a:H-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2)的MS图；图11是化合物三(相关杂质b:H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2)的HPLC图；图12是化合物三(相关杂质b:H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2)的MS图；图13是化合物四(相关杂质c:H-Tyr-Ile-Gln-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改进的Fmoc多肽固相合成缩宫素的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)以Rink Amide AM 树脂为固相载体，以Fmoc保护氨基酸为单体，N末端为Boc‑Cys(Acm)‑OH，哌嗪溶液为脱帽试剂，在缩合剂和碱性条件作用下，依次逐个接上氨基酸，合成缩宫素；2)用碘脱去Acm同时在固相载体上形成二硫键，得到环化保护缩宫素序列；3)进行切肽，浓缩，得到缩宫素的粗品；4)将粗品提纯后，得到缩宫素产品。

【技术特征摘要】
1.一种改进的Fmoc多肽固相合成缩宫素的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)以Rink Amide AM 树脂为固相载体，以Fmoc保护氨基酸为单体，N末端为Boc-Cys(Acm)-OH，哌嗪溶液为脱帽试剂，在缩合剂和碱性条件作用下，依次逐个接上氨基酸，合成缩宫素；2)用碘脱去Acm同时在固相载体上形成二硫键，得到环化保护缩宫素序列；3)进行切肽，浓缩，得到缩宫素的粗品；4)将粗品提纯后，得到缩宫素产品。2.根据权利要求1所述的一种改进的Fmoc多肽固相合成缩宫素的方法，其特征在于：所述的缩宫素氨基酸序列为。3.根据权利要求2所述的一种改进的Fmoc多肽固相合成缩宫素的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的Rink Amide AM 树脂的取代率为0.55mmol/g。4.根据权利要求3所述的一种改进的Fmoc多肽固相合成缩宫素的方法，其特征在于：步骤1）中，保护的氨基酸单体为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(T...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙鹏程，
申请(专利权)人：兰州凯博药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62