本发明专利技术提供了一种具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白及其应用，属于蛋白质工程技术领域。本发明专利技术将经过人工设计的霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌的DNA序列进行合成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术的融合蛋白免疫原性好，特异性强，能够有效通过粘膜进入生物机体，并能使机体产生中和抗体，可作为免疫佐剂用于生物制品的制备，市场价值显著。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒免疫领域，具体地，涉及具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白及其应用。
技术介绍
免疫佐剂又称非特异性免疫增生剂。本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性(见抗原)或改变免疫反应类型。免疫佐剂种类很多，目前尚无统一的分类方法，常用的佐剂可分为4类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如费氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。佐剂的作用包括：(1)增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；(2)佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；(3)佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能；(4)良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。黏膜是机体防御外来入侵的第一道天然屏障，在机体的免疫中担当着重要任务。黏膜系统包括消化道系统、呼吸系统、生殖系统等表面覆盖的黏膜系统。许多传染性疾病感染是主要发生在粘膜系统或是从粘膜表面开始入侵的。因此很多情况下，通过疫苗来诱导粘膜系统的保护性抗体是这些疾病的防治所必需的。然而，通过粘膜途径给予可溶性抗原存在两个问题：在粗糙的粘膜环境中如何保持抗原的完整性、如何增强抗原的免疫原性。因此需要专门的呈递系统和佐剂。目前研究的比较多的佐剂有：CT/LT、内源性分子(细胞因子、趋化因子等)、CpG、皂角苷等。细菌毒素及其衍生物作为粘膜佐剂——霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素霍乱毒素(Choleratoxin，CT)是由革兰氏阴性细菌——霍乱弧菌(Vibriocholerae)分泌的一种蛋白，它是亚洲霍乱疾病中引起严重腹泻的化学物质。而大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)是由肠道毒素型E coli(ETEC)产生的。它们是目前研究得最多的粘膜免疫佐剂。CT、LT及其衍生物的粘膜佐剂活性研究CT和LT都是很强的粘膜佐剂，当它们和抗原连结在一起或者和抗原简单混合后经口或鼻内免疫，能诱导有效的黏膜及系统免疫应答。这种毒素蛋白的佐剂作用最早是由Clements等证明的，研究指出LT可以增加联合免疫的抗原(OvA)的血清抗体反应，增加幅度是比单独用OVA及PBS对照组分别高30、90倍。研究发现，CT和LT能影响粘膜免疫反应过程中的许多步骤。可能对这些步骤的影响各自或者协同的使CT和LT拥有了强大的佐剂活性。CT和LT产生的影响有：a.影响肠内上皮细胞的通透性，使共同免疫的抗原能够更好的被细胞所吸收；b.能够促进抗原被各种细胞吸收；c.促进B细胞分化，使IgA的形成增加；d.复合物的刺激对T细胞的增殖和细胞因子的产生能起到刺激或者抑制的作用。但是由于CT和LT的毒性太强了，并不能直接用于人身上。因此，近年来有许多研究都尝试把这些蛋白的佐剂作用和它们的毒性作用分开，希望能研究出没有毒性的CT和LT作为人类粘膜免疫的佐剂。CT是细菌蛋白毒素AB5家族的成员，具有两个亚单位，CTA和CTB。5个CTB和1个CTA非共价结合成圆桶状五聚体，能够高亲和力地与细胞表面的神经节苷脂GM1结合，具有优良的免疫原性。通常认为CTA具有毒性，因而开发应用较少，本专利技术建立CTA的部分氨基酸结合金黄色葡萄球菌的局部氨基酸的人工蛋白，具备无毒和良好免疫原性的CTA佐剂来源。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生物学活性高的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白及其应用。本专利技术的第一个方面提供了一种具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白，具有：(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。本专利技术的第二个方面是提供编码所述具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的基因。优选的，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本专利技术的第三个方面是提供了所述具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的表达载体。优选的，所述原核表达载体是将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与pET30a载体进行连接所获得的。本专利技术的第四个方面是提供含有所述的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白、其编码基因或原核表达载体的宿主细胞。可选的，所述宿主细胞可以为BL21(de3)大肠杆菌株。本专利技术的第五个方面提供所述具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的纯化方法，将经过DNA分析和蛋白结构分析确认的蛋白序列对应的DNA序列进行合成，并引入Nde I和Xho I酶切位点，以商品化质粒为基础载体，构建表达载体，所述蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA序列如SEQ ID NO.2所示，通过亲和层析纯化和蛋白复性，得到具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白。本专利技术的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的氨基酸序列中，其中来自霍乱弧菌毒素A亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其与金黄色葡萄球菌氨基酸序列通过GGGSGGGSGGGS连接；来自金黄色葡萄球菌的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。在SEQ ID NO.1的氨基酸序列中，有重复的两个SEQ ID NO.4所示金黄色葡萄球菌的氨基酸序列，重复序列以GGGS进行连接。含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的生物制品属于本专利技术的保护范围。含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的检测试剂属于本专利技术的保护范围。含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的疫苗佐剂属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白在制备疫苗佐剂或疫苗中的用途。本专利技术提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白在制备疫苗佐剂或疫苗中的用途。本专利技术提供的上述具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白免疫原性好，特异性强，能够有效通过粘膜进入生物机体，并能使机体产生中和抗体，可作为免疫佐剂用于生物制品的制备，市场价值显著。附图说明图1为本专利技术具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的Western Blot分析。图2为具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白与细胞表面的神经节苷脂GM1结合活性，从左到右依次是BSA，水，煮过的本专利技术蛋白，本专利技术蛋白。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。实施例1具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白蛋白的制备和纯化将经过DNA分本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白，其特征在于，具有：(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白，其特征在于，具有：(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经缺失、插入或替换所获得的具有相同功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的基因，其特征在于，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经缺失、插入或替换所获得的核苷酸序列。3.含有权利要求2所述基因的表达载体。4.含有权利要求1所述的具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。5.权利要求1所述所述具有霍乱弧菌毒素A亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白的表达纯化方法，将经过DNA分析和蛋白结构分析确认的蛋白序列对应的DNA序列进行合成，并引入Nde...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹健荣，
申请(专利权)人：北京岱瑞汛生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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