一种C-Ps单克隆抗体及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种可稳定分泌肺炎琏球菌C多糖(C‑Ps)单克隆抗体的杂交瘤细胞株5B3B9，所述的杂交瘤细胞产生的C‑Ps单克隆抗体特异性强，制备方法简单，可用于C‑Ps的免疫学检测分析，由所述C‑Ps单克隆抗体制备的C‑Ps检测试剂盒，特别是胶体金免疫检测体系，使用方便，检测准确率和灵敏度高，稳定性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术
，具体涉及一种可稳定分泌肺炎琏球菌C多糖(C-Ps)单克隆抗体的杂交瘤细胞株、C-Ps单克隆抗体及C-Ps检测试剂盒。
技术介绍
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)属革兰氏阳性菌，是引起肺炎、中耳炎、脑膜炎等疾病的常见病原体，严重时可引起非常高的死亡率，到目前为止肺炎球菌已经分离出90多种不同的血清型，其能否致病与荚膜有密切关系，因荚膜能抵抗人体内吞噬细胞的吞噬作用而大量繁殖，引起疾病。有荚膜和无荚膜肺炎球菌半数致死量的试验证明荚膜是肺炎球菌的主要毒力因子。肺炎链球菌C-多糖(C-Ps)是所有肺炎球菌血清型共有的抗原，因此可作为检测不同亚型肺炎球菌的抗原。专利CN200510084709.5公开了一种采用肺炎链球菌菌株R6的C-多糖抗原亲和纯化的兔抗-肺炎链球菌菌株R6的抗体，并将上述抗体与金颗粒偶联，并以上述抗体制备样品捕获线，以山羊抗-家兔免疫球蛋白(IgG)制备对照线，制备了一种ICT装置用于检测肺炎链球菌抗原，由于采用的标记抗体和捕获抗菌均为多克隆抗体，特异性不高，检测的灵敏度和准确率也不高。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术提供一种杂交瘤细胞株5B3B9，可稳定分泌C-多糖单克隆抗体，该杂交瘤细胞株于2016年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12694。所述的杂交瘤细胞由以下方法制备得到：(1)抗原制备采用哥伦比亚培血平板培养肺炎链球菌，用无菌生理盐水冲洗制成菌悬液，灭活；(2)小鼠免疫选用4-8周龄Balb/C小鼠，以步骤(1)灭活的肺炎链球菌菌悬液为免疫抗原，免疫剂量为50-200μl/只，免疫2-7次；(3)细胞融合取步骤(2)免疫后的小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞，按照10:1～1:1的比例混合后，离心，加入PEG溶液，再加入RPMI-1640培养基，终止反应，离心，使用RPMI-1640培养基重悬，培养，次日加入HAT培养基稀释至工作浓度，培养至长出细胞团后测定细胞上清；(4)杂交瘤细胞筛选通过间接ELISA法测定步骤(3)的细胞上清中C-Ps抗体，筛选阳性母细胞株，采用有限稀释法进行克隆化确定阳性细胞株5B3B9；(5)杂交瘤细胞鉴定培养步骤(4)得到的5B3B9细胞株，吸取细胞上清，通过间接ELISA法，鉴定细胞阳性；优选的，上述制备方法还包括：(6)杂交瘤细胞保存。优选的，步骤(1)中，所述的哥伦比亚培血平板为含10％羊血的哥伦比亚培养基；所述的培养时间为18-20h；优选的，所述的菌悬液浓度为1×107-1×109个细胞/ml，更优选为2×108个细胞/ml；优选的，步骤(2)中，选用的小鼠为4-6周龄Balb/C雌性小鼠；免疫方式为小鼠腿部肌肉注射免疫抗原；免疫剂量为100μl/只；免疫次数为3次，更优选为每14天免疫1次，同剂量免疫3次；优选的，步骤(3)中，免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的混合比例为5:2；所述的PEG溶液为PEG1450溶液；优选的，步骤(3)和(4)中，所述的融合后的细胞培养条件为37℃、5％CO2培养箱中培养；优选的，步骤(4)和(5)中，所述的间接ELISA法测定抗体的过程为：以碳酸盐缓冲液为包被液，将包被抗原标准品C-多糖，做倍比稀释包被ELISA板，100μl/孔，4℃过夜包被，次日拍干，洗板两次，37℃封闭1h后拍干；每孔依次加入100μl经倍比稀释的细胞上清，37℃封闭孵1h，PBST洗涤3次；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG加入每孔孵育1h，PBST洗涤4次；最后每孔加入100μlTMB显色液，暗处反应15min，终止反应，酶标仪检测波长为450nm处的吸光度值；更优选的，所述的筛选是以融合前小鼠血清100倍稀释作为阳性对照，以空白培养基作为阴性对照，筛选出细胞培养上清的OD450值高于阴性对照2.1倍且OD450值最高的阳性母细胞株。在本专利技术的一个实施例中，所述的步骤(3)包括：无菌条件下取步骤(2)免疫后小鼠的脾脏研磨制备细胞悬液，与SP2/0骨髓瘤细胞，按照5：2的比例混合后，600-1000rpm离心5-10min，逐滴加入1ml PEG 1450溶液，再加入RPMI-1640培养基至20ml，终止反应，600-1000rpm离心5-10min，使用含20％胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬，培养于96孔细胞培养板，每孔200μl，次日加入HAT培养基稀释至工作浓度，37℃、5％CO2培养箱中培养，待长出细胞团后测定细胞上清。在本专利技术的一个实施例中，所述的步骤(4)包括：通过间接ELISA法，以融合前小鼠血清100倍稀释作为阳性对照，以空白培养基作为阴性对照，筛选出OD450值高于阴性对照2.1倍，且OD450值最高的阳性母细胞株，扩大培养至24孔板，培养至长满80％，有限稀释法稀释至每200μl包含1个杂交瘤细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养，培养至长满80％-90％待长出细胞团后测定细胞上清；重复上述稀释培养方法三次，确定最终阳性细胞株 5B3B9细胞株。优选的，步骤(6)中，以10％DMSO+90％胎牛血清作为冻存液，将经过步骤(5)鉴定的杂交瘤细胞做冻存于液氮中。本专利技术还提供一种C-Ps单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株5B3B9产生。所述的C-Ps单克隆抗体由以下方法制备得到：取上述杂交瘤细胞的悬浮液，腹腔注入Balb/C小鼠，小鼠腹部膨大后，处死小鼠，取其腹水，离心，取上清，纯化得到C-Ps单克隆抗体。优选的，所述的小鼠腹腔注入杂交瘤细胞的悬浮液的剂量为0.1×106-5×106个细胞；更优选为1×106个细胞；在本专利技术的一个实施例中，所述的C-Ps单克隆抗体由以下方法制备得到：(1)取6-8周龄Balb/C小鼠，注射器吸取福氏不完全佐剂0.5ml于小鼠腹腔内注射；(2)杂交瘤细胞培养7天左右时间，将培养细胞吹打下来，离心(600-1000r/min，8min)，弃去上清，用无血清RPMI-1640培养液悬浮，并将细胞数调至2×106个，腹腔内注入0.5ml/只；(3)小鼠接种杂交瘤细胞后8-15天，腹部膨大后，立即拉颈处死小鼠，对其腹部皮肤进行酒精棉消毒，无菌环境下用注射器吸取腹水；(4)将收集的腹水混合，离心(9500r/min，30min)2遍，收集上清；(5)采用Protein-A亲和层析法纯化上清中的抗体。本专利技术还提供一种上述C-Ps单克隆抗体在C-Ps检测分析中的应用。本专利技术还提供一种C-Ps的检测试剂盒，所述的试剂盒包括C-Ps单克隆抗体；所述的C-Ps单克隆抗体可为现有技术中已公开的针对C-Ps的单克隆抗体，也可为本专利技术上述C-Ps单克隆抗体；优选为上述C-Ps单克隆抗体。优选的，上述试剂盒还包括C-Ps的多克隆抗体和/或第二抗体，所述的C-Ps多克隆抗体可通过使用抗原免疫动物后从其血清中提纯得到，本领域技术人员可根据多克隆抗体的常规生产方法制备得到，本专利技术对此不作限定；所述的第二抗体为能与C-Ps单克隆抗体或多克隆抗体特异性结合的抗体，即抗C-Ps抗体的抗体；优选的，上述试剂盒中的示踪标记物选自：放射性同位本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种保藏编号为CGMCC No.12694的杂交瘤细胞株。

【技术特征摘要】
1.一种保藏编号为CGMCC No.12694的杂交瘤细胞株。2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞由以下方法制备得到：(1)抗原制备采用哥伦比亚培血平板培养肺炎链球菌，用无菌生理盐水冲洗制成菌悬液，灭活；(2)小鼠免疫选用4-8周龄Balb/C小鼠，以步骤(1)灭活的肺炎链球菌菌悬液为免疫抗原，免疫剂量为50-200μl/只，免疫2-7次；(3)细胞融合取步骤(2)免疫后的小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞，按照10:1～1:1的比例混合后，离心，加入PEG溶液，再加入RPMI-1640培养基，终止反应，离心，使用RPMI-1640培养基重悬，培养，次日加入HAT培养基稀释至工作浓度，培养至长出细胞团后测定细胞上清；(4)杂交瘤细胞筛选通过间接ELISA法测定步骤(3)的细胞上清中C-Ps抗体，筛选阳性母细胞株，采用有限稀释法进行克隆化确定阳性细胞株5B3B9；(5)杂交瘤细胞鉴定培养步骤(4)得到的5B3B9细胞株，吸取细胞上清，通过间接ELISA法，鉴定细胞阳性。3.一种C-Ps单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生。4.一种C-Ps的检测试剂盒，所述的试剂盒包括C-Ps单克隆抗体。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的C-Ps...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕辰，隋秀文，邵忠琦，朱涛，宇学峰，毛慧华，邱东旭，
申请(专利权)人：天津康希诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12