本发明专利技术公开了一种三七的病程相关蛋白1家族基因PnPR1‑2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，本发明专利技术通过功能基因组学相关技术研究证实PnPR1‑2基因具有提高植物抗真菌的功能，将本发明专利技术抗真菌PnPR1‑2基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，结果转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性，超表达PnPR1‑2的转基因烟草对茄腐镰刀菌、轮枝镰刀菌、串珠状赤霉菌、人参链格孢等多种真菌的生长具有明显的抑制作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌活性的三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2及应用。
技术介绍
植物病害是农业生产中一个非常棘手的问题，尤其是真菌病害，约占到植物总病害的80％，严重影响农作物的产量和品质。传统的病害防治方法取得了一定成效，一是依靠传统育种方法培育抗性品种，二是化学农药的使用，三是采取轮作等耕作制度。然而，这些方法都存在或多或少的弊端，如抗性品种培育的周期长、化学农药残留高且极易造成环境污染、耕作制度调整则费时费力，所以传统控制植物病害的方法均不能彻底解决问题。随着重组DNA技术的创立和发展，利用基因工程技术来培育抗病植物新品种已取得初步成效，且有望从根本上解决真菌病害问题。植物具有保护自身免受各种病原体侵害的防卫机制。在植物体受到病原体入侵时，植物通过迅速改变抗病相关基因表达来对病原菌和外部胁迫做出反应，诱导一些特殊蛋白的重新合成，如病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs）。植物细胞在病原菌攻击后使病原的侵染局部化，并在侵染的部位形成坏死斑限制病原的扩展（Loon LCV, Strien EAV. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1999, 55(2): 85-97）。PRs基因是植物防卫系统的重要组成部分，与超敏反应（hypersensitive response，HR）及系统获得性抗性（systematic acquire resistance，SAR）密切相关，它的诱导表达常作为SAR建立的标志，同时其基因编码产物已成为近年来抗性研究的热点之一。PR1首先在被TMV侵染的烟草叶片中检测到，它与超敏反应及系统获得抗性密切相关。植物获得性系统抗性是指在同一植物上未感染部位出现的抗性，这种抗性在植物受到再次侵染时，不仅对与初次感染相同的病原物表现出抗性，而且往往对其他类型的病原物也起作用(Carr JP, Beachy RN, Klessig DF. Are the PR1 proteins of tobacco involved in genetically engineered resistance to TMV?. Virology, 1989, 169(2): 470-473)。经TMV感染后诱导的烟草系统获得抗性，不仅对TMV本身有作用，而且对其他的病原物如烟草枯斑病毒、真菌和细菌也有抵抗作用（郭金芳, 潘俊松, 王琛, 赵智燕, 何亚丽. 病程相关蛋白与植物抗病性关系的研究及其在草坪草抗病育种中的应用. 草业学报, 2008, 17(6): 156-163）。植物的SAR可能包括多种机制，但是，烟草对真菌、细菌或病毒的共同反应都是产生PR1，并且在具有系统获得抗性的未感染的叶片上也出现PR1蛋白，这说明PR1和植物的SAR之间有紧密的联系。 水杨酸（salicylic acid，SA）能通过诱导植物体中PR1基因的表达，提高植物的抗病性。在HR发生前，有一个短暂的氧爆发阶段，使细胞中活性氧的浓度明显提高。而活性氧可以直接杀伤病原物、参与膜脂过氧化、导致HR，而且能促进寄主细胞壁木质化，增强细胞壁的结构，诱导木质素的产生。同时H2O2是一种能自由扩散的小分子，可以跨过细胞膜进入病原物侵染以外的组织中，作为第二信使来激活防卫基因的表达，提高植物抗病性。SA是将病害和创伤的信息传递到植物其他部分的信号分子之一（Métraux JP. Recent breakthroughs in the study of salicylic acid biosynthesis. Trends in Plant Science, 2002, 7(8): 332-334）。SA是诱发PR1的信号分子，病菌侵染植物体后，活性氧瞬时达到高峰，寡糖素转化为水杨酸，通过胞内信号传递，PR1基因表达开始表达，产生菌类细胞壁水解酶（吴建丽, 郝建军. 水杨酸与植物诱导抗病性. 辽宁林业科技, 2005, (1): 33-35）。本专利技术的病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2来自三七（Panax notoginseng）。三七主产于云南文山州砚山县、马关、西畴、广南、麻栗坡、富宁、邱北等，另广西田阳、靖西、田东、德保等地也有种植。云南文山州三七历史悠久、产量大、质量好，为著名的道地药材。三七常年生长在阴蔽环境中，病害发生较为严重。三七上发生的病害主要的有根腐病、黑斑病、圆斑病、疫病、白粉病等，三七每年都因病害的大面积发生造成极为严重的损失。因此，加强三七抗病机制研究以及抗性基因克隆迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从三七中克隆获得编码具有抗真菌活性的病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2，三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因cDNA全长序列为852bp，包含一个501bp的开放阅读框、104bp的5’非翻译区、247bp的3’非翻译区，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。本专利技术中PnPR1-2基因的编码区是序列表SEQ ID NO：1中第105-605位所示的核苷酸序列。本专利技术分离三七的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，专利技术人将这个基因命名为PnPR1-2。PR1蛋白具有与体外抑菌活性，是植物受病原物侵染或非生物因子刺激后产生的一类水溶性蛋白。PR1蛋白通过攻击病原物、降解细胞壁大分子、降解病原物毒素等途径来提高植物对病原菌的抗性。本专利技术涉及分离包含PnPR1-2的DNA片段并鉴定其功能，其中所述DNA片段如序列表SEQ ID NO：1所示，对该基因进行序列分析，发现PnPR1-2全长cDNA为852 bp，包含一个501 bp的开放阅读框(ORF)、104bp的5’非翻译区(untranslated region，UTR)、247 bp的3’UTR，其中ORF编码一个具有166个氨基酸的蛋白质。通过NCBI/BIastp进行同源性分析表明，PnPR1-2基因编码蛋白与葡萄（Vitis hybrid cultivar）、烟草（Nicotiana sylvestris）PR1蛋白相似性分别为68%、63%。PnPR1-2基因编码一个由166个氨基酸残基组成的蛋白质，生物信息学分析结果显示PnPR1-2蛋白质分子质量约为18.1KD，等电点为9.16。超表达序列表SEQ ID NO：1所示序列可以增强烟草对茄腐镰刀菌（Fusarium solani）、轮枝镰刀菌（F. verticillioides）、串珠状赤霉菌（Gibberella monilif本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1‑2，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。2.根据权利要求1所述三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2，其特征在于：PnPR1-2基因的编码区是序列表SEQ ID NO：1中第105-605位所示...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘迪秋，崔秀明，白智伟，曲媛，杨野，关瑞攀，陈瑞，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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