后肾间充质细胞的制备方法技术

本发明专利技术提供一种后肾间充质细胞的制备方法，通过将Foxd1cre转基因小鼠与DTRflox转基因小鼠进行交配，分离胚鼠肾脏，培养胚肾细胞，通过加入白喉毒素提取高纯度的Foxd1+后肾间充质细胞。与目前已报道的分离特定细胞表型后肾间充质细胞的方法相比，本方法操作简单，所提取的Foxd1+后肾间充质细胞成分单一，纯度高；Foxd1+后肾间充质细胞提取量可控，可实现Foxd1+后肾间充质细胞的大规模生产制备。

Method for preparing posterior renal mesenchymal cells

The invention provides a preparation method of metanephric mesenchymal cells, the Foxd1cre transgenic mice and DTRflox transgenic mice were mated, kidney isolated rat embryo culture, embryo kidney cells, extraction of high purity Foxd1+ metanephric mesenchymal cells by the addition of diphtheria toxin. Compared with the method of separation of specific cell phenotypes reported in metanephric mesenchymal cells, this method has the advantages of simple operation, Foxd1+ extracted from metanephric mesenchymal cells with single component, high purity; Foxd1+ of metanephric mesenchymal cells extracted controllable, large-scale production system to achieve the Foxd1+ of renal mesenchymal cells preparation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程和分子生物学领域，具体地说，涉及后肾间充质细胞的制备方法。
技术介绍
哺乳动物肾脏是由后肾输尿管芽与后肾间充质相互作用发育而来的，前者发育成为输尿管和集合管，后者可分成两群细胞，即帽状间充质细胞(标志物为Six2)和间质间充质细胞(标志物为Foxd1)。在肾脏发育/胚肾细胞相关研究中，有时需要将后肾间充质细胞，甚至特定细胞表型的后肾间充质细胞分离出来，既往的研究仅在所需的特定天数取出胚肾、剪断、培养分离胚肾细胞，如需要特定细胞表型的后肾细胞(以Foxd1+细胞为例)，将分离的后肾间充质细胞进行Foxd1荧光染色，然后通过流式细胞术筛选分离Foxd1+细胞。目前已报道的分离特定细胞表型后肾间充质细胞的方法不仅步骤繁琐，且存在细胞成份不确定、细胞产量低等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种后肾间充质细胞的制备方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术通过将Foxd1cre转基因小鼠与DTRflox转基因小鼠进行交配，分离胚鼠肾脏，培养胚肾细胞，通过加入白喉毒素提取高纯度的标志物Foxd1阳性(Foxd1+)的后肾间充质细胞。本专利技术提供的后肾间充质细胞的制备方法，将Foxd1cre转基因小鼠与DTR(白喉毒素受体)flox转基因小鼠进行交配，获取雌鼠受孕开始后第13.5-15.5天内的胚胎(优选地，以发现有阴道栓记为E0.5天，将雌鼠喂养至第E13.5-15.5天)，分离胚肾，将胚肾剪碎后接种于干细胞专用培养基中进行培养，同时对各胚胎的基因型进行鉴定，筛选出基因型为Foxd1-cre；DTR-flox的双转基因型胚肾，培养60-72小时后向培养基中加入终浓度100-150ng/ml(优选100ng/ml)的白喉毒素，每48小时用含100-150ng/ml(优选100ng/ml)白喉毒素的干细胞专用培养基换液1次，直至培养5-7天，收集到的存活细胞即为Foxd1+后肾间充质细胞。其中，Foxd1cre转基因小鼠购自美国Jackson实验室(Stock No:012463)。DTRflox转基因小鼠由耶鲁大学Lloyd Cantley教授惠赠(Guo J K,Shi H,Koraishy F,et al.The Terminator mouse is a diphtheria toxin–receptor knock-in mouse strain for rapid and efficient enrichment of desired cell lineages[J].Kidney international,2013,84(5):1041-1046.)。本专利技术中涉及的干细胞专用培养基为C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基，由赛业(广州)生物科技有限公司生产，商品编号MUBMX-90011。前述的方法，胚肾剪碎后接种于干细胞专用培养基中，于37℃、5％CO2条件下培养2-3天。前述的方法，对各胚胎的基因型进行鉴定，筛选基因型为Foxd1-cre；DTR-flox的双转基因型胚肾的具体方法如下，包括以下步骤：S1、Foxd1-cre转基因小鼠的鉴定S11、胚鼠鼠尾基因组DNA提取；S12、采用PCR法进行检测：PCR反应体系：DNA模板2μl，25μM上、下游引物各0.3μl，2×EasyTag SuperMix 10μl，ddH2O补足至总体积20μl；PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，重复35个循环；72℃ 10min，4℃维持；S13、结果检测：配制1.5％琼脂糖凝胶，每孔加入PCR反应产物5μl，在140V电压下电泳20min，在凝胶成像系统中观察电脉结果，如果出现约450bp大小的扩增条带，则鉴定为Foxd1-cre转基因小鼠；其中，S12中所用引物序列如下：上游引物F1 5’-TCTGGTCCAAGAATCCGAAG-3’，下游引物R1 5’-GGGAGGATTGGGAAGACAAT-3’；S2、Foxd1-cre；DTR-flox双转基因型小鼠的鉴定S21、以上述鉴定为Foxd1-cre转基因小鼠的胚胎为材料，提取胚鼠鼠尾基因组DNA；S22、采用PCR法进行检测：PCR反应体系：DNA模板2μl，25μM上、下游引物各0.3μl，2×EasyTag SuperMix 10μl，ddH2O补足至总体积20μl；PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，50℃ 45s，72℃ 30s，重复35个循环；72℃ 10min，4℃维持；S23、配制1.5％琼脂糖凝胶，每孔加入PCR反应产物5μl，在140V电压下电泳20min，在凝胶成像系统中观察电脉结果，如果出现约650bp大小的扩增条带，则鉴定为Foxd1-cre；DTR-flox双转基因型小鼠；其中，S22中所用引物序列如下：上游引物F2 5’-ACCATGAAGCTGCTGCCGTC-3’，下游引物R2 5’-TCAGTGGGAATTAGTCATGC-3’；S3、从上述鉴定为Foxd1-cre；DTR-flox双转基因型小鼠的胚胎中分离胚肾，即为基因型为Foxd1-cre；DTR-flox的双转基因型胚肾。本专利技术以Foxd1cre转基因小鼠与DTRflox转基因小鼠为基础，通过交配获得胚鼠，在Foxd-cre；DTR-flox双转基因胚鼠体内，不表达Foxd1的细胞将表达DTR，这类细胞接触白喉毒素后将死亡，而表达Foxd1的细胞不表达DTR，接触白喉毒素后仍存活(图1)。胚肾Foxd1+后肾间充质细胞在Cre与loxP发生作用，使位于loxP间的DTRpA基因片段(白喉毒素受体)沉默，从而不表达DTR，因此对白喉毒素无反应；而非Foxd1+的其它胚肾细胞，由于loxP-DTRpA-loxP继续表达DTR，加入白喉毒素后细胞将死亡。利用这一原理提取高纯度的Foxd1+后肾间充质细胞。用Real-time PCR检测未经培养基中加入白喉毒素进行提取分离的后肾间充质细胞以及采用上述方法提取的Foxd1+后肾间充质细胞的Foxd1和Six2的表达情况，结果如图2所示，Foxd1+后肾间充质细胞高表达Foxd1，且几乎不表达Six2，由此可以确定通过本专利技术方法成功提取到了高纯度的Foxd1+后肾间充质细胞。本专利技术具有以下优点：(一)与目前已报道的分离特定细胞表型后肾间充质细胞的方法相比，本方法操作简单，所提取的Foxd1+后肾间充质细胞成分单一，纯度高；(二)Foxd1+后肾间充质细胞提取量可控，可实现Foxd1+后肾间充质细胞的大规模生产制备。附图说明图1为本专利技术Foxd1+后肾间充质细胞的制备原理。图2为本专利技术实施例1中Foxd1+后肾间充质细胞与后肾间充质细胞Foxd1和Six2的表达水平比较。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1 Foxd1+后肾间充质细胞的制备首先将Foxd1cre转基因小鼠与DTRflox转基因小鼠进行交配，每天早晚两次观察雌鼠是否受孕(是否有阴道栓)，如发现有阴道栓记为E0.5天，将雌鼠拿出单本文档来自技高网...

【技术保护点】
后肾间充质细胞的制备方法，其特征在于，将Foxd1cre转基因小鼠与DTRflox转基因小鼠进行交配，分离胚鼠肾脏，培养胚肾细胞，通过加入白喉毒素提取标志物Foxd1阳性的后肾间充质细胞。

【技术特征摘要】
1.后肾间充质细胞的制备方法，其特征在于，将Foxd1cre转基因小鼠与DTRflox转基因小鼠进行交配，分离胚鼠肾脏，培养胚肾细胞，通过加入白喉毒素提取标志物Foxd1阳性的后肾间充质细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将Foxd1cre转基因小鼠与DTRflox转基因小鼠进行交配，获取雌鼠受孕开始后第13.5-15.5天内的胚胎，分离胚肾，将胚肾剪碎后接种于干细胞专用培养基中进行培养，同时对各胚胎的基因型进行鉴定，筛选出基因型为Foxd1-cre；DTR-flox的双转基因型胚肾，培养60-72小时后向培养基中加入终浓度100-150ng/ml的白喉毒素，每48小时用含100-150ng/ml白喉毒素的干细胞专用培养基换液1次，直至培养5-7天，收集到的存活细胞即为标志物Foxd1阳性的后肾间充质细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述干细胞专用培养基为赛业生物科技有限公司生产的C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基，商品编号MUBMX-90011。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，胚肾剪碎后接种于干细胞专用培养基中，于37℃、5％CO2条件下培养2-3天。5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，对各胚胎的基因型进行鉴定，筛选基因型为Foxd1-cre；DTR-flox的双转基因型胚肾的具体步骤如下：S1、Foxd1-cre转基因小鼠的鉴定S11、胚鼠鼠尾基因组DNA提取；S12、采用PCR法进行检测：PCR反应体系：DNA模板2μl，25μM上、下游引物各0.3μl，2×EasyTag SuperMix 10μl，ddH2O补足至总体积20μl；PCR反应条件：94...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈香美，李清刚，金美玲，傅博，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11