检测septin9基因甲基化的引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测septin9基因甲基化的引物及试剂盒，引物包括目的基因引物对Septin9正向引物F和Septin9反向引物R。试剂盒中除包括上述引物外，优选还包括内参基因引物，TaqMan‑MGB探针和两个Blocker引物，试剂盒操作简便、易于判读，对仪器的要求不高，并且整个PCR过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，使结果更加精准。对比于用PCR特异性引物进行检测的方法，利用探针对甲基化位点进行识别，具有更高的灵敏度、精准性。而且通过两个Blocker引物能严格控制非特异性条带的扩增，使试剂盒检测灵敏度更高、特异性更好，特别适用于结直肠癌血浆游离DNA的早期筛查。

Primer and kit for detecting septin9 gene methylation

The invention discloses a primer and a kit for detecting the methylation of septin9 gene. The primers include the primer of the target gene and the reverse primer Septin9 and Septin9 of the F positive primer R. In addition to including the primer kit, preferably also includes reference gene primers, TaqMan MGB probes and two Blocker primers, kit is simple, easy to read, the instrument is not high, and the whole PCR process with full closed form, to avoid cross contamination may make the results more accurate. Compared with the method of using PCR specific primers to detect the methylation site, it has higher sensitivity and accuracy. Moreover, two Blocker primers can be used to control the amplification of non-specific bands, so that the kit is more sensitive and specific, and is especially suitable for early screening of free DNA in colorectal cancer.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及疾病的基因诊断
，特别是一种与结直肠癌相关的基因septin9甲基化的检测。
技术介绍
结直肠癌是世界第三大高发癌症，每年因结直肠癌死亡的患者可达60万。早期结直肠癌患者的5年生存率约为80％，由于结直肠癌早期往往无特殊症状，容易延误治疗时机，至晚期时生存率仅为10％左右。2000年以前，欧美一些国家就已在全国推广结直肠癌高危人群的筛查。2006年，美国50岁至75岁的人群中，60％的人至少参加过一次结直肠癌的筛查。近年来，我国恶性肿瘤中结直肠癌发病率位列第三，高达31/10万，直追欧美国家。然而，患者的早诊率远落后于国外，确诊时约60％的患者是中晚期。如果大肠癌在早期能够准确检测到，这样就能够尽早进行预防和治疗，提高治愈率，并且能够降低治疗成本。目前来讲，结直肠癌早期诊断主要有以下三种方式：1、粪便潜血试验(gFOBT)或免疫法粪便潜血试验(FIT)；2、进行结肠镜检查；3、CT结肠成像。现在，粪便潜血首推的是FIT，这与gFOBT存在很大不同。2008年一项对比gFOBT和FIT的研究显示，在做大规模筛查时，FIT的依从性较好为60％，gFOBT为47％；FIT的敏感性为5.5％，而gFOBT为2.4％；CRC和进展期腺癌的发生率FIT为1.4％，高于gFOBT的0.6％。对于结肠镜检测，2009年一项研究显示，全结肠镜检查可以降低左半的CRC死亡风险，但是在右半，全结肠镜检查并不能对死亡率有较大改善。对于左右半结果不同的原因目前存在争议。有观点认为，左右半结果不同是因为很多结肠镜检测并没有评估所有右半的结肠，最重要的是左右两侧的结肠具有不同的生物学特性，右半结肠息肉较少，呈扁平状，很容易漏检。粪便潜血检查的灵敏度相对较低，而结肠镜检查具有很大的创伤性。所以需一种同时具备检测灵敏度高、创伤性小的结直肠癌早期筛查的方法。Septin9基因位于常染色体17q25.3，作为高度保守的GTP结合蛋白广泛存在于人类细胞，研究显示Septin9基因甲基化在CRC及部分癌前病变患者外周血中有较高的检出率，由于仅需要抽取外周静脉血，故其患者依从性较高。利用分子检测手段，对结直肠癌的早期筛查具有无创性，检测灵敏度高。DNA异常甲基化是人类肿瘤常见的改变。发生在启动子区以及基因内部的CpG岛异常甲基化是基因失活的最常见机制。目前检测DNA甲基化检测方法有：甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)、亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)、高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)和高通量测序方法等。相对于其他的检测方法而言，亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)是DNA甲基化检测中的“金标准”，检测较为精准，但其检测灵敏度相对较低，且操作较繁琐、成本高。高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)在PCR扩增中通过观察熔解曲线的变化来判断DNA是否发生甲基化，此类方法结果分析相对复杂。高通量测序检测方法主要是涉及到的成本太高，不利于临床上的推广。对于甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)检测方法，操作简便、耗时较短，结果易于分析。专利公开号CN104164516A(公开日2014.11.26)公开了一种基于人结直肠癌特异性甲基化检测的引物及试剂盒，是针对SEPTIN9基因的启动子区域设计了一对用于人结直肠癌特异性甲基化检测的PCR引物，对辅助诊断结直肠癌有一定作用，但其特异性和灵敏度仍然有待提高。
技术实现思路
为了解决现有技术对于结直肠癌相关基因septin9基因的甲基化情况检测灵敏度和特异性不高的问题，本专利技术提供了一对新的检测引物，另外基于该引物对，本专利技术还提供了一种简单方便的检测试剂盒。本专利技术提供的检测septin9基因甲基化的引物，包括目的基因引物对，其核苷酸序列如下所示：Septin9正向引物F：5'-CCGAAATAATCCCATCCAAC-3'(SEQ ID NO.1)，Septin9反向引物R：5'-GCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTAT-3'(SEQ ID NO.2)。本专利技术基于甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)方法，设计了一对针对septin9基因-1200bp到-1500bp这一片段甲基化位点的引物。研究表明，这一位点的甲基化程度相对较高，具备重要的临床检测意义。本专利技术还提供了一种检测septin9基因甲基化的试剂盒，包括以上所述的引物。制备成试剂盒，更加方便携带使用。优选地，上述检测septin9基因甲基化的试剂盒，还包括内参基因引物对，其核苷酸序列如下：内参基因(β-actin)正向引物F：5'-GTGATGGAGGAGGTTTAG-3'(SEQ ID NO.3)，内参基因(β-actin)反向引物R：5'-AAATTACAAAAACCACAA-3'(SEQ ID NO.4)。其一，增加内参基因的检测，对样本基因组检测起到对照作用，排除内源因素的干扰；其二，增加内参的检测，结合靶基因对样本结果进行判读，提高检测的准确性。优选地，上述检测septin9基因甲基化的试剂盒，还包括两个TaqMan-MGB探针，分别为septin9基因探针和内参基因(β-actin)探针，其核苷酸序列如下：septin9基因探针：5'-TTATGTCGGATTTCGCGGTTAA-3'(SEQ ID NO.5)，内参基因(β-actin)探针：5'-CACCACCCAACACACAATAACAAAC-3'(SEQ ID NO.6)；两个探针的5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团，且两个探针的荧光报告基团显示的颜色不同。在选取特异性探针序列的同时，相比普通的taqman探针，利用MGB探针进行检测，能够增加检测的灵敏度和特异性，提高检测结果的准确性。优选地，上述检测septin9基因甲基化的试剂盒，septin9基因探针核苷酸序列5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；内参基因(β-actin)探针核苷酸序列5'端标记VIC，3'端标记BHQ1。通过利用不同荧光基团标记的方式，能够更好的将靶基因与内参基因区分开来，对结果的判读一目了然，更加清楚。优选地，上述检测septin9基因甲基化的试剂盒，还包括两个Blocker引物，核苷酸序列如下：Blocker1引物：5'-ACCCGCTGCCCACCAGCCATCATG-CY3-3'(SEQ ID NO.7)，Blocker2引物：5'-TATGTTGGATTTTGTGGTTAATGTGTA-CY3-3'(SEQ ID NO.8)；两个Blocker引物的3’端均标记有荧光染料CY3，以阻止Blocker引物的扩增过程。在PCR扩增过程中，目的片段的引物容易与未发生甲基化的基因片段以及未发生重亚硫酸盐转化的基因片段结合，出现突破扩增，进而产生非特异性扩增条带，影响最终的判读结果。因此，本试剂盒在扩增体系中额外增加了多条Blocker引物，目的是让这条引物特异性与本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测septin9基因甲基化的引物，其特征在于，包括目的基因引物对，其核苷酸序列如下所示：Septin9正向引物F：5'‑CCGAAATAATCCCATCCAAC‑3'，Septin9反向引物R：5'‑GCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTAT‑3'。

【技术特征摘要】
1.检测septin9基因甲基化的引物，其特征在于，包括目的基因引物对，其核苷酸序列如下所示：Septin9正向引物F：5'-CCGAAATAATCCCATCCAAC-3'，Septin9反向引物R：5'-GCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTAT-3'。2.检测septin9基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的检测septin9基因甲基化的试剂盒，其特征在于，还包括内参基因引物对，其核苷酸序列如下：内参基因(β-actin)正向引物F：5'-GTGATGGAGGAGGTTTAG-3'，内参基因(β-actin)反向引物R：5'-AAATTACAAAAACCACAA-3'。4.根据权利要求3所述的检测septin9基因甲基化的试剂盒，其特征在于，还包括两个TaqMan-MGB探针，分别为septin9基因探针和内参基因(β-actin)探针，其核苷酸序列如下：septin9基因探针：5'-TTATGTCGGATTTCGCGGTTAA-3'，内参基因(β-actin)探针：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘沛，王林海，
申请(专利权)人：北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11