本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体的说是一种泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM‑CATHs及其应用。泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM‑CATHs，FM‑CATH1和FM‑CATH2为直链多肽，分子量分别为3815.7Da和3773.6Da，等电点均为12.33。本发明专利技术克隆得到泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM‑CATH1和FM‑CATH2的编码基因，并利用化学合成的方法合成了FM‑CATH1和FM‑CATH2。该抗菌肽具有极强的抗菌活性，且细胞毒性和溶血活性低。
Cathelicidin family antibacterial peptide from Rana Rana and application thereof
The invention belongs to the field of biomedical technology, in particular to a frog source cathelicidin family of antibacterial peptide FM CATHs and its application. The frog cathelicidin family of antibacterial peptide FM CATHs, FM CATH1 and FM CATH2 straight chain polypeptide, the molecular weight is 3815.7Da and 3773.6Da respectively, the isoelectric point was 12.33. The cloned gene encoding cathelicidin family Ranidae antibacterial peptide FM CATH1 and FM CATH2, and using the method of chemical synthesis of FM CATH1 and FM CATH2 synthesis. The antibacterial peptide has strong antibacterial activity and low cytotoxicity and hemolytic activity.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学
，具体的说是一种泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs及其应用。
技术介绍
由于传统抗生素的大规模滥用导致病原微生物抗药性不断增强，严重影响了人类生活和健康。为应对抗药微生物，不断使用耐药微生物尚未使用过的新的或者替代性的抗生素是主要解决措施，因此这就需要持续开发新的抗微生物药物。抗菌肽，是生物机体在抵御病原微生物的防御反应中所产生的一类抗微生物与一些肿瘤细胞的小分子多肽。抗菌肽抗菌谱广，不仅对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有较强的杀灭作用，对某些真菌、原生动物，甚至对耐药性细菌也具有杀灭作用，因此极有可能成为一种高效、低毒且无残留危害的抗菌、抗病毒、抗癌新药。截至目前，已从不同生物体中发现超过1500多种不同的抗菌肽，而且其数目还在增加。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽，泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs，FM-CATH1和FM-CATH2为直链多肽，分子量分别为3815.7Da和3773.6Da，等电点均为12.33。所述泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATH1氨基酸序列为：Arg1Thr2Arg3Arg4Ala5Ile6Lys7Lys8Leu9Lys10Thr11Lys12Val13Leu14Asn15Lys16Leu17Lys18Gln19Lys20Leu21Gln22Ala23Val24Gly25Asn26Leu27Ile28Gly29Ser30Val31Ile32Lys33Ala34；泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATH2氨基酸序列为：Arg1Thr2Arg3Arg4Ala5Ile6Lys7Lys8Leu9Lys10Thr11Lys12Ala13Leu14Asn15Lys16Leu17Lys18Gln19Lys20Leu21Gln22Ala23Val24Gly25Asn26Leu27Ile28Gly29Ser30Val31Ile32Lys33Gly34。所述编码泽蛙cathelin家族抗菌肽FM-CATH1和FM-CATH2前体为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示碱基序列。一种泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs的应用，所述泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs在用于制备抗细菌药物、防腐剂、动物饲料或化妆品前体中的应用。本专利技术所具有的优点：本专利技术克隆得到泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs的编码基因，并利用化学合成的方法合成了FM-CATHs。该类抗菌肽具有极强的抗菌活性和较低的细胞毒性和溶血活性。具体实施方式下面用实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但本专利技术的内容并不局限于此。实施例1泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs编码基因的克隆：1)泽蛙肺部总RNA提取：①取300mg泽蛙肺部组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1m1总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Invitrogen公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％(V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为泽蛙肺部抗菌肽总RNA。2)泽蛙肺部cDNA文库构建：采用CLONTECH公司In-Fusion SMARTer TMDirectional cDNA Library Construction Kit。(1)cDNA第一链合成(mRNA反转录)：①经DEPC处理(DEPC处理是在含0.1％(V/V)DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干)的离心管中加入1μl泽蛙肺部总RNA、1μl 3’端一链合成引物(3’In-Fusion SMARTer CDS Primer)和2.5μl经DEPC处理(DEPC处理是将含0.1％(V/V)DEPC的水，放置过夜，高压灭菌)的水使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。②在上述离心管中加入以下试剂(均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer TMDirectional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备)，2.0μl 5×第一链缓冲液、0.25μl 100mM DTT、1.0μl 10mM dNTP Mix、1.0μl SMARTer V寡核苷酸、0.25μl核糖核酸酶抑制剂和1.0μl SMARTScribe反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm，30s)，在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。(2)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer TM Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备)①将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲液、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAXX-XXX-3’)、2μl CDS III/3’PCR引物(5’-CGGGGTACGATGAGACACCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT VN-3’,N＝A,C,G或T，V＝A,G或C)以及2μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix在95℃预热的PCR管中进行混合。②在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。(3)泽蛙cathelicidin家族抗菌肽基因克隆筛选：根据两栖类动物cathelicidin家族抗菌肽编码基因信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为5’-GGATGAAGATCTGGCAGTGTGTG-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer TM Directional cDNA Library Construction Kit中的3’-PCR引物，其序列为5’-TACGCGACGCGATACGCGAAT-3’。PCR反应在如下条件下进行：94℃5min，94℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化进CaCl2-MgCl2法制备本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽，其特征在于：泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM‑CATHs，FM‑CATH1和FM‑CATH2为直链多肽，分子量分别为3815.7Da和3773.6Da，等电点均为12.33。
【技术特征摘要】
1.一种泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽，其特征在于：泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATHs，FM-CATH1和FM-CATH2为直链多肽，分子量分别为3815.7Da和3773.6Da，等电点均为12.33。2.按权利要求1所述泽蛙来源cathelicidin家族抗菌肽，其特征在于：所述泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATH1氨基酸序列为：Arg1Thr2Arg3Arg4Ala5Ile6Lys7Lys8Leu9Lys10Thr11Lys12Val13Leu14Asn15Lys16Leu17Lys18Gln19Lys20Leu21Gln22Ala23Val24Gly25Asn26Leu27Ile28Gly29Ser30Val31Ile32Lys33Ala34；泽蛙cathelicidin家族抗菌肽FM-CATH2氨基...
【专利技术属性】
技术研发人员：王爱丽，王义鹏，于海宁，
申请(专利权)人：潍坊科技学院，
类型：发明
国别省市：山东;37
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