新型腔肠素底物及其使用方法技术
The new substrate coelenterazine and method of use thereof
Polynucleotide for encoding modified luciferase polypeptide and substrate. OgLuc SEQ ID variant polypeptides and NO:1 has at least 60% amino acid sequence has at least one amino acid replacement identity and position of the amino acid corresponding to the SEQ ID NO:1 in the. The polypeptides corresponding to the OgLuc variant polypeptides with respect to the wild type of the genus spiny fish have at least one of enhanced luminescence, enhanced signal stability and enhanced protein stability.
【技术实现步骤摘要】
相关申请的交叉引用本申请要求于2010年11月2日提交的美国临时申请号61/409,422的优先权，其以其整体通过引用并入本文。背景已显示从深海虾细角刺虾(Oplophorus gracilirostris)分泌的荧光素酶具有许多令人感兴趣的特点，比如高活性、高量子产量和宽泛的底物特异性(包括，例如，腔肠素(coelenterazine)以及多种腔肠素类似物)。当腔肠素(底物)与分子氧的氧化由刺虾属荧光素酶催化时，发生刺虾属的生物发光反应，导致462nm处的最大强度的光和产物CO2和coelenteramide(Shimomura等，Biochemistry,17:994(1978))。最佳发光在40℃下在0.05-0.1M NaCl存在下在pH 9时发生，并且，由于该酶对热的独特的耐性，当使用高纯度的酶时，可见发光在高于50℃的温度下发生，或当使用部分纯化的酶时，在高于70℃时发生。在pH 8.7时，Shimomura等(1978)报道天然荧光素酶具有约130kDa的分子量，显然每个包括4个31kDa的单体；在较低pH时，天然荧光素酶趋于聚合。近期研究已显示细角刺虾荧光素酶是35kDa和19kDa天然蛋白质的复合物，即，由两个19kDa组分和两个35kDa组分组成的异四聚体。Inouye等(2000)报道了编码刺虾属荧光素酶的35kDa和19kDa蛋白质的cDNA的分子克隆，和催化发光反应的蛋白质组分的鉴定。编码所述蛋白质的cDNA在细菌细胞和哺乳动物细胞中表达，且19kDa蛋白质被鉴定为能够催化腔肠素的发光氧化反应的组分(Inouye 等，2000)。刺...
【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少60％氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽相对于非刺虾属荧光素酶具有增强的发光。
【技术特征摘要】
2010.11.02 US 61/409,4221.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少60％氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽相对于非刺虾属荧光素酶具有增强的发光。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述非刺虾属荧光素酶是海肾属荧光素酶。3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述非刺虾属荧光素酶是萤火虫荧光素酶。4.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少60％氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO:3的OgLuc多肽具有增强的发光，条件是由所述多核苷酸编码的所述多肽不是表47中所列的那些其中之一。5.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少60％氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO:31的多肽具有增强的发光，条件是由所述多核苷酸编码的所述多肽不是SEQ ID NO:3或15。6.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少60％氨基酸序列同一性的OgLuc变体多肽，所述OgLuc变体多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸的位置处包括至少一个氨基酸置换，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO:29的多肽具有增强的发光，条件是由所述多核苷酸编码的所述多肽不是SEQ ID NO:3或15。7.如权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸，其中所述多肽与SEQ ID NO:1具有至少80％氨基酸序列同一性。8.如权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸，其中所述多肽与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性。9.如权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO:3的所述多肽具有增强的蛋白质稳定性或增强的生物相容性中的至少一项。10.如权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽相对于海肾属荧光素酶具有增强的酶稳定性或增强的生物相容性中的至少一项。11.如权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽相对于萤火虫荧光素酶具有增强的酶稳定性或增强的生物相容性中的至少一项。12.如权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，其中在腔肠素的存在下所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO:3的多肽具有增强的发光。13.如权利要求1-12中任一项所述的多核苷酸，其中在式(Ia)或(Ib)的化合物存在下所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO:3的多肽具有增强的发光：其中R2选自由或C2-5直链烷基组成的组；R6选自由-H、-OH、-NH2、-OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；R8选自由H或低级环烷基组成的组；其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；W为-NH2、卤代、-OH、-NHC(O)R、-CO2R；X为-S-、-O-或-NR22-；Y为-H、-OH或-OR11；Z为-CH-或-N-；每个R11独立地为-C(O)R”或-CH2OC(O)R”；R22为H、CH3或CH2CH3；每个R独立地为C1-7直链烷基或C1-7支链烷基；R”为C1-7直链烷基或C1-7支链烷基；虚线的键表示任选的环的存在，其可以是饱和的或不饱和的；条件为当R2为或时，R8不为条件为当R2为时，R8是或低级环烷基；和前提条件是当R6为NH2时，R2为，或C2-5烷基；或R8不为14.如权利要求1-13中任一项所述的多核苷酸，其中与不同的腔肠素相比较在腔肠素的存在下所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO:3的多肽具有相对底物特异性的改变。15.如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸，其中与天然的或已知的腔肠素相比较在式(Ia)或(Ib)的化合物存在下所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO:3的多肽具有相对底物特异性的改变：其中R2选自由或C2-5直链烷基组成的组；R6选自由-H、-OH、-NH2、-OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；R8选自由H或低级环烷基组成的组；其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；W为-NH2、卤代、-OH、-NHC(O)R、-CO2R；X为-S-、-O-或-NR22-；Y为-H、-OH或-OR11；Z为-CH-或-N-；每个R11独立地为-C(O)R”或-CH2OC(O)R”；R22为H、CH3或CH2CH3；每个R独立地为C1-7直链烷基或C1-7支链烷基；R”为C1-7直链烷基或C1-7支链烷基；虚线的键表示任选的环的存在，其可以是饱和的或不饱和的；前提条件是当R2为时，R8不为前提条件是当R2为时，R8是或低级环烷基；和前提条件是当R6为NH2时，R2为，或C2-5烷基；或R8不为16.如权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽相对于SEQ ID NO:3的所述多肽具有增强的生物相容性。17.如权利要求1-16中任一项所述的多核苷酸，其中在腔肠素的存在下所述OgLuc变体多肽相对于海肾属荧光素酶具有增强的发光。18.如权利要求1-17中任一项所述的多核苷酸，其中在式(Ia)或(Ib)的化合物存在下所述OgLuc变体多肽相对于海肾属荧光素酶具有增强的发光：其中R2选自由或C2-5直链烷基组成的组；R6选自由-H、-OH、-NH2、-OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；R8选自由H或低级环烷基组成的组；其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；W为-NH2、卤代、-OH、-NHC(O)R、-CO2R；X为-S-、-O-或-NR22-；Y为-H、-OH或-OR11；Z为-CH-或-N-；每个R11独立地为-C(O)R”或-CH2OC(O)R”；R22为H、CH3或CH2CH3；每个R独立地为C1-7直链烷基或C1-7支链烷基；R”为C1-7直链烷基或C1-7支链烷基；虚线的键表示任选的环的存在，其可以是饱和的或不饱和的；前提条件是当R2为时，R8不为前提条件是当R2为时，R8是或低级环烷基；和前提条件是当R6为NH2时，R2为，或C2-5烷基；或R8不为19.如权利要求1-18中任一项所述的多核苷酸，其中与不同的腔肠素相比较在腔肠素的存在下OgLuc变体多肽相对于海肾属荧光素酶具有相对底物特异性的改变。20.如权利要求1-19中任一项所述的多核苷酸，其中与天然的或已知的腔肠素相比较在式(Ia)或(Ib)的化合物存在下所述OgLuc变体多肽相对于海肾属荧光素酶具有相对底物特异性的改变：其中R2选自由或C2-5直链烷基组成的组；R6选自由-H、-OH、-NH2、-OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；R8选自由H或低级环烷基组成的组；其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；W为-NH2、卤代、-OH、-NHC(O)R、-CO2R；X为-S-、-O-或-NR22-；Y为-H、-OH或-OR11；Z为-CH-或-N-；每个R11独立地为-C(O)R”或-CH2OC(O)R”；R22为H、CH3或CH2CH3；每个R独立地为C1-7直链烷基或C1-7支链烷基；R”为C1-7直链烷基或C1-7支链烷基；虚线的键表示任选的环的存在，其可以是饱和的或不饱和的；前提条件是当R2为时，R8不为前提条件是当R2为时，R8是或低级环烷基；和前提条件是当R6为NH2时，R2为，或C2-5烷基；或R8不为21.如权利要求1-20中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽相对于海肾属荧光素酶具有增强的生物相容性。22.如权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸，其中在腔肠素存在下的所述OgLuc变体多肽相对于在荧光素存在下的萤火虫荧光素酶具有增强的发光。23.如权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸，其中相对于在荧光素存在下的萤火虫荧光素酶在式(Ia)或(Ib)的化合物存在下所述OgLuc变体多肽具有增强的发光：其中R2选自由或C2-5直链烷基组成的组R6选自由-H、-OH、-NH2、-OC(O)R或-OCH2OC(O)R组成的组；R8选自由H或低级环烷基组成的组；其中R3和R4均为H或均为C1-2烷基；W为-NH2、卤代、-OH、-NHC(O)R、-CO2R；X为-S-、-O-或-NR22-；Y为-H、-OH或-OR11；Z为-CH-或-N-；每个R11独立地为-C(O)R”或-CH2OC(O)R”；R22为H、CH3或CH2CH3；每个R独立地为C1-7直链烷基或C1-7支链烷基；R”为C1-7直链烷基或C1-7支链烷基；虚线的键表示任选的环的存在，其可以是饱和的或不饱和的；前提条件是当R2为时，R8不为前提条件是当R2为时，R8是或低级环烷基；和前提条件是当R6为NH2时，R2为，或C2-5烷基；或R8不为24.如权利要求1-23中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽相对于萤火虫荧光素酶具有增强的生物相容性。25.如权利要求1-24中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽来自细角刺虾(Oplophorus gracilirostris)、Oplophorus grimaldii、Oplophorus spinicauda、Oplophorus foliaceus、Oplophorus novaezealandiae、典型刺虾(Oplophorus typus)或Oplophorus spinosus。26.如权利要求1-25中任一项所述的多核苷酸，其中所述至少一个氨基酸置换在对应于SEQ ID NO:1的第1位、第4位、第6位、第10位、第11位、第14位、第15位、第16位、第18位、第19位、第20位、第21位、第22位、第23位、第24位、第25位、第27位、第28位、第31位、第32位、第33位、第34位、第36位、第38位、第39位、第40位、第42位、第43位、第44位、第45位、第46位、第47位、第48位、第49位、第50位、第51位、第54位、第55位、第56位、第58位、第59位、第60位、第66位、第67位、第68位、第69位、第70位、第71位、第72位、第74位、第75位、第76位、第77位、第86位、第87位、第89位、第90位、第92位、第93位、第94位、第95位、第96位、第97位、第98位、第99位、第100位、第102位、第106位、第109位、第110位、第111位、第112位、第113位、第117位、第119位、第124位、第125位、第126位、第127位、第128位、第129位、第130位、第135位、第136位、第138位、第139位、第142位、第145位、第146位、第147位、第148位、第149位、第150位、第152位、第154位、第155位、第158位、第159位、第163位、第164位、第166位、第168位或第169位或其组合的位置。27.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中所述增强的OgLuc变体多肽还包括对应于以下中的至少一个的置换：对应于SEQ ID NO:1的F1I、E4K、F6Y、W10Y、R11Q、A14V/S、G15R、Y16E、Q18D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/R/S/V/W/Y、D19N、Q20P/R、V21L/M、L22I/F、E23K、Q24A、G25L、L27M/V/A/D/G/I、S28Y、F31I、Q32H/L/P、A33N/M、L34M、V36E/M、V38F/I、T39I、P40T/I/L/Q、Q42H、K43N/R、I44F、V45E、L46Q、S47P、G48R、E49D/G/K、N50K/S、G51E/R/V、A54I/S、D55E/G、I56V、V58I/L、I59T、I60V、S66T/N、G67D/S、F68L/S/W/Y/D、Q69H、M70V、G71D、L72A/C/F/G/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y、E74I/K、M75F/K、I76F/N/V、F77A/C/D/G/M/N/S/T/V/W/Y、H86L/R、H87N/T、K89E、I90D/K/P/Q/R/T/V/Y、L92A/G/H/M/Q/R/S/Y、H93R、Y94F、G95D/S、T96A、L97E、V98F、I99T/V、D100I、V102E/M/T、M106I/K、Y109F、F110I、G111N、R112C、P113H/T/K、I117F、V119M、K124M、I125L、T126R、V127A、T128A/S、G129Q、T130K、N135D/Y、L136M、I138S、D139G、L142V/E/K/W、P145L/Q、D146G、G147N、S148T、L149I/M、L150V、R152H/S/E/T、T154S、I155T、V158I、T159I/S、L163I、C164S、N166I/F/E、L168F或A169V或其组合。28.如权利要求1-27中任一项所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述多肽包括以下氨基酸中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的第1位的异亮氨酸、第4位的赖氨酸、第6位的酪氨酸、第10位的酪氨酸、第11位的谷氨酰胺、第14位的缬氨酸或丝氨酸、第15位的精氨酸、第16位的谷氨酸、第18位的天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸、第19位的天冬酰胺、第20位的精氨酸或脯氨酸、第21位的亮氨酸或蛋氨酸、第22位的异亮氨酸或苯丙氨酸、第23位的赖氨酸、第24位的丙氨酸、第25位的亮氨酸、第27位的缬氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸或异亮氨酸、第28位的酪氨酸、第31位的异亮氨酸、第32位的脯氨酸、组氨酸或亮氨酸、第33位的天冬酰胺或蛋氨酸、第34位的蛋氨酸、第36位的蛋氨酸或谷氨酸、第38位的异亮氨酸或苯丙氨酸、第39位的异亮氨酸、第40位的苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺、第42位的组氨酸、第43位的天冬酰胺或精氨酸、第44位的苯丙氨酸、第45位的谷氨酸、第46位的谷氨酰胺、第47位的脯氨酸、第48位的精氨酸、第49位的天冬氨酸、甘氨酸或赖氨酸、第50位的赖氨酸或丝氨酸、第51位的谷氨酸、精氨酸或缬氨酸、第54位的丝氨酸或异亮氨酸、第55位的甘氨酸或谷氨酸、第56位的缬氨酸、第58位的异亮氨酸或亮氨酸、第59位的苏氨酸、第60位的缬氨酸、第66位的苏氨酸或天冬酰胺、第67位的丝氨酸或天冬氨酸、第68位的亮氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、酪氨酸或色氨酸、第69位的缬氨酸、第70位的缬氨酸、第71位的天冬氨酸、第72位的谷氨酰胺、丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸、第74位的赖氨酸或异亮氨酸、第75位的赖氨酸或苯丙氨酸、第76位的天冬酰胺、苯丙氨酸或缬氨酸、第77位的丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸、第86位的精氨酸或亮氨酸、第87位的天冬酰胺或苏氨酸、第89位的谷氨酸、第90位的天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸或酪氨酸、第92位的丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸或酪氨酸、第93位的精氨酸、第94位的苯丙氨酸、第95位的丝氨酸或天冬氨酸、第96位的丙氨酸、第97位的谷氨酸、第98位的苯丙氨酸、第99位的苏氨酸或缬氨酸、第100位的异亮氨酸、第102位的蛋氨酸、谷氨酸或苏氨酸、第106位的异亮氨酸或赖氨酸、第109位的苯丙氨酸、第110位的异亮氨酸、第111位的天冬酰胺、第112位的半胱氨酸、第113位的组氨酸、苏氨酸或赖氨酸、第117位的苯丙氨酸、第119位的蛋氨酸、第124位的蛋氨酸、第125位的亮氨酸、第126位的精氨酸、第127位的丙氨酸、第128位的丙氨酸或丝氨酸、第129位的谷氨酰胺、第130位的赖氨酸、第135位的天冬氨酸或酪氨酸、第136位的蛋氨酸、第138位的丝氨酸、第139位的甘氨酸、第142位的缬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或色氨酸、第145位的亮氨酸或谷氨酰胺、第146位的甘氨酸、第147位的天冬酰胺、第148位的苏氨酸、第149位的异亮氨酸或蛋氨酸、第150位的缬氨酸、第152位的组氨酸、丝氨酸、谷氨酸或苏氨酸、第154位的丝氨酸、第155位的苏氨酸、第158位的异亮氨酸、第159位的丝氨酸或异亮氨酸、第163位的异亮氨酸、第164位的丝氨酸、第168位的苯丙氨酸或第169位的缬氨酸或其组合。29.如权利要求1-28中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽包括对应于SEQ ID NO:1的氨基酸置换A4E、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138I和N166R，和对应于以下的位置处的至少一个另外的氨基酸置换：SEQ ID NO:1的第1位、第4位、第6位、第11位、第14位、第15位、第18位、第19位、第20位、第21位、第22位、第23位、第27位、第28位、第31位、第32位、第33位、第34位、第36位、第38位、第39位、第40位、第42位、第43位、第44位、第45位、第46位、第47位、第48位、第49位、第50位、第51位、第54位、第55位、第56位、第58位、第59位、第60位、第66位、第67位、第68位、第69位、第70位、第71位、第72位、第74位、第75位、第76位、第77位、第86位、第89位、第90位、第92位、第93位、第94位、第95位、第96位、第98位、第99位、第102位、第106位、第109位、第110位、第112位、第113位、第117位、第119位、第124位、第126位、第127位、第128位、第135位、第136位、第138位、第139位、第142位、第145位、第148位、第149位、第152位、第154位、第155位、第158位、第159位、第163位、第164位、第168位或第169位，或其组合。30.如权利要求1-29中任一项所述的多核苷酸，其中所述对应于SEQ ID NO:1的第4位的氨基酸是谷氨酸，第11位的氨基酸是精氨酸，第33位的氨基酸是赖氨酸，第44位的氨基酸是异亮氨酸，第54位的氨基酸是苯丙氨酸，第115位的氨基酸是谷氨酸，第124位的氨基酸是赖氨酸，第138位的氨基酸是异亮氨酸和第166位的氨基酸是精氨酸，和对应于以下的位置处的至少一个另外的氨基酸置换：SEQ ID NO:1的第1位、第4位、第6位、第11位、第14位、第15位、第18位、第19位、第20位、第21位、第22位、第23位、第27位、第28位、第31位、第32位、第33位、第34位、第36位、第38位、第39位、第40位、第42位、第43位、第44位、第45位、第46位、第47位、第48位、第49位、第50位、第51位、第54位、第55位、第56位、第58位、第59位、第60位、第66位、第67位、第68位、第69位、第70位、第71位、第72位、第74位、第75位、第76位、第77位、第86位、第89位、第90位、第92位、第93位、第94位、第95位、第96位、第98位、第99位、第102位、第106位、第109位、第110位、第112位、第113位、第117位、第119位、第124位、第126位、第127位、第128位、第135位、第136位、第138位、第139位、第142位、第145位、第148位、第149位、第152位、第154位、第155位、第158位、第159位、第163位、第164位、第168位或第169位，或其组合。31.如权利要求29或30所述的多核苷酸，其中所述至少一个氨基酸置换对应于以下中的至少一个：SEQ ID NO:1的F1I、E4K、F6Y、R11Q、A14V、G15R、Q18D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/R/S/V/W/Y、D19N、Q20P/R、V21L/M、L22I/F、E23K、L27M/V、S28Y、F31I、Q32H/L/P、A33N/M、L34M、V36E/M、V38F/I、T39I、P40T、Q42H、K43N/R、I44F、V45E、L46Q、S47P、G48R、E49D/G/K、N50K/S、G51E/R/V、A54I/S、D55E/G、I56V、V58I/L、I59T、I60V、S66T/N、G67D/S、F68L/S/W/Y/D、Q69H、M70V、G71D、L72A/C/F/G/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y、E74I/K、M75F/K、I76F/N/V、F77A/C/D/G/M/N/S/T/V/W/Y、H86L/R、K89E、I90D/K/P/Q/R/T/V/Y、L92A/G/H/M/Q/R/S/Y、H93R、Y94F、G95D/S、T96A、V98F、I99T/V、V102E/M、M106I/K、Y109F、F110I、R112C、P113H/T、I117F、V119M、K124M、T126R、V127A、T128A/S、N135D/Y、L136M、I138S、D139G、L142V、P145L/Q、S148T、L149I、R152H/S、T154S、I155T、V158I、T159I/S、L163I、C164S、L168F或A169V，或其组合。32.如权利要求29或30所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的多肽包括以下氨基酸中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的第1位的异亮氨酸、第4位的赖氨酸、第6位的酪氨酸、第11位的谷氨酰胺、第14位的缬氨酸、第15位的精氨酸、第18位的天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸、第19位的天冬酰胺、第20位的精氨酸或脯氨酸、第21位的亮氨酸或蛋氨酸、第22位的异亮氨酸或苯丙氨酸、第23位的赖氨酸、第27位的缬氨酸或蛋氨酸、第28位的酪氨酸、第31位的异亮氨酸、第32位的脯氨酸、组氨酸或亮氨酸、第33位的天冬酰胺或蛋氨酸、第34位的蛋氨酸、第36位的蛋氨酸或谷氨酸、第38位的异亮氨酸或苯丙氨酸、第39位的异亮氨酸、第40位的苏氨酸、第42位的组氨酸、第43位的天冬酰胺或精氨酸、第44位的苯丙氨酸、第45位的谷氨酸、第46位的谷氨酰胺、第47位的脯氨酸、第48位的精氨酸、第49位的天冬氨酸、甘氨酸或赖氨酸、第50位的赖氨酸或丝氨酸、第51位的谷氨酸、精氨酸或缬氨酸、第54位的丝氨酸或异亮氨酸、第55位的甘氨酸或谷氨酸、第56位的缬氨酸、第58位的异亮氨酸或亮氨酸、第59位的苏氨酸、第60位的缬氨酸、第66位的苏氨酸或天冬酰胺、第67位的丝氨酸或天冬氨酸、第68位的天冬氨酸、丝氨酸、酪氨酸或色氨酸、第69位的组氨酸、第70位的缬氨酸、第71位的天冬氨酸、第72位的谷氨酰胺、丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸、第74位的赖氨酸或异亮氨酸、第75位的赖氨酸或苯丙氨酸、第76位的天冬酰胺、苯丙氨酸或缬氨酸、第77位的丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸、第86位的精氨酸或亮氨酸、第89位的谷氨酸、第90位的天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸或酪氨酸、第92位的丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸或酪氨酸、第93位的精氨酸、第94位的苯丙氨酸、第95位的丝氨酸或天冬氨酸、第96位的丙氨酸、第98位的苯丙氨酸、第99位的苏氨酸或缬氨酸、第102位的蛋氨酸、谷氨酸、第106位的异亮氨酸或赖氨酸、第109位的苯丙氨酸、第110位的异亮氨酸、第112位的半胱氨酸、第113位的组氨酸或苏氨酸、第117位的苯丙氨酸、第119位的蛋氨酸、第124位的蛋氨酸、第126位的精氨酸、第127位的丙氨酸、第128位的丙氨酸或丝氨酸、第135位的天冬氨酸或酪氨酸、第136位的蛋氨酸、第138位的丝氨酸、第139位的甘氨酸、第142位的缬氨酸、第145位的亮氨酸或谷氨酰胺、第148位的苏氨酸、第149位的异亮氨酸、第152位的组氨酸或苏氨酸、第154位的丝氨酸、第155位的苏氨酸、第158位的异亮氨酸、第159位的丝氨酸或异亮氨酸、第163位的异亮氨酸、第164位的丝氨酸、第168位的苯丙氨酸或第169位的缬氨酸，或其组合。33.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽包括对应于SEQ ID NO:1的氨基酸置换A4E、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138I和N166R，和对应于以下的位置处的至少一个氨基酸：SEQ ID NO:1的第1位、第4位、第14位、第15位、第18位、第20位、第22位、第23位、第27位、第33位、第38位、第39位、第43位、第49位、第54位、第55位、第56位、第58位、第59位、第66位、第67位、第68位、第70位、第71位、第72位、第75位、第76位、第77位、第89位、第90位、第92位、第93位、第102位、第106位、第109位、第113位、第117位、第126位、第127位、第136位、第139位、第145位、第148位、第163位、第164位或第169位，或其组合。34.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中对应于SEQ ID NO:1的第4位的氨基酸是谷氨酸，第11位的氨基酸是精氨酸，第33位的氨基酸是赖氨酸，第44位的氨基酸是异亮氨酸，第54位的氨基酸是苯丙氨酸，第115位的氨基酸是谷氨酸，第124位的氨基酸是赖氨酸，第138位的氨基酸是异亮氨酸和第166位的氨基酸是精氨酸，和对应于以下的位置处的至少一个另外的氨基酸置换：SEQ ID NO:1的第1位、第4位、第14位、第15位、第18位、第20位、第22位、第23位、第27位、第33位、第38位、第39位、第43位、第49位、第54位、第55位、第56位、第58位、第59位、第66位、第67位、第68位、第70位、第71位、第72位、第75位、第76位、第77位、第89位、第90位、第92位、第93位、第102位、第106位、第109位、第113位、第117位、第126位、第127位、第136位、第139位、第145位、第148位、第163位、第164位或第169位，或其组合。35.如权利要求33或34所述的多核苷酸，其中所述编码的OgLuc变体多肽还包括对应于以下中的至少一种的置换：SEQ ID NO:1的F1I、E4K、A14V、G15R、Q18D/F/G/H/I/K/L/M/N/P/R/S/W/Y、Q20R、L22I、E23K、L27M/V、A33N、V38I、T39I、K43R、E49K、A54I/S、D55G、I56V、V58I/L、I59T、S66T/N、G67S、F68S/W/Y/D、M70V、G71D、L72A/C/F/G/H/I/M/N/P/Q/R/S/T/V/W/Y、M75F/K、I76N、F77A/C/D/G/M/S/T/V/W/Y、K89E、I90D/K/P/Q/R/T/V/Y、L92A/G/H/M/Q/S/Y、H93R、V102E、M106K、Y109F、P113T、I117F、T126R、V127A、L136M、D139G、P145L、S148T、L163I、C164S或A169V，或其组合。36.如权利要求33或34所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述多肽包括以下氨基酸中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的第1位的异亮氨酸、第4位的赖氨酸、第14位的缬氨酸、第15位的精氨酸、第18位的天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸、第20位的精氨酸、第22位的异亮氨酸、第23位的赖氨酸、第27位的缬氨酸或蛋氨酸、第33位的天冬酰胺、第38位的异亮氨酸、第39位的异亮氨酸、第43位的精氨酸、第49位的赖氨酸、第54位的丝氨酸或异亮氨酸、第55位的甘氨酸、第56位的缬氨酸、第58位的异亮氨酸或亮氨酸、第59位的苏氨酸、第66位的苏氨酸或天冬酰胺、第67位的丝氨酸、第68位的亮氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、酪氨酸或色氨酸、第70位的缬氨酸、第71位的天冬氨酸、第72位的谷氨酰胺、丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸、第75位的赖氨酸或苯丙氨酸、第76位的天冬酰胺、第77位的色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或蛋氨酸、第89位的谷氨酸、第90位的天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸或酪氨酸、第92位的丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸或酪氨酸、第93位的精氨酸、第102位的谷氨酸、第106位的赖氨酸、第109位的苯丙氨酸、第113位的苏氨酸、第117位的苯丙氨酸、第126位的精氨酸、第127位的丙氨酸、第136位的蛋氨酸、第139位的甘氨酸、第145位的亮氨酸、第148位的苏氨酸、第163位的异亮氨酸、第164位的丝氨酸或第169位的缬氨酸，或其组合。37.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中所述OgLuc变体多肽包括对应于SEQ ID NO:1的氨基酸置换A4E、Q11R、A33K、V44I、A54F、P115E、Q124K、Y138I和N166R，和对应于以下的位置处的至少一个另外的氨基酸置换：对应于SEQ ID NO:1的第1位、第4位、第6位、第11位、第18位、第19位、第20位、第21位、第22位、第27位、第28位、第31位、第32位、第33位、第34位、第36位、第38位、第40位、第42位、第43位、第44位、第45位、第46位、第47位、第48位、第49位、第50位、第51位、第54位、第55位、第58位、第60位、第66位、第67位、第68位、第69位、第70位、第72位、第74位、第75位、第76位、第77位、第86位、第90位、第92位、第94位、第95位、第96位、第98位、第99位、第102位、第106位、第109位、第110位、第112位、第113位、第119位、第124位、第128位、第135位、第138位、第142位、第145位、第149位、第152位、第154位、第155位、第158位、第159位或第168位，或其组合。38.如权利要求1-26中任一项所述的多核苷酸，其中对应于SEQ ID NO:1的第4位的氨基酸是谷氨酸，第11位的氨基酸是精氨酸，第33位的氨基酸是赖氨酸，第44位的氨基酸是异亮氨酸，第54位的氨基酸是苯丙氨酸，第115位的氨基酸是谷氨酸，第124位的氨基酸是赖氨酸，第138位的氨基酸是异亮氨酸，和第166位的氨基酸是精氨酸，和对应于以下的位置处的至少一个另外的氨基酸置换：对应于SEQ ID NO:1的第1位、第4位、第6位、第11位、第18位、第19位、第20位、第21位、第22位、第27位、第28位、第31位、第32位、第33位、第34位、第36位、第38位、第40位、第42位、第43位、第44位、第45位、第46位、第47位、第48位、第49位、第50位、第51位、第54位、第55位、第58位、第60位、第66位、第67位、第68位、第69位、第70位、第72位、第74位、第75位、第76位、第77位、第86位、第90位、第92位、第94位、第95位、第96位、第98位、第99位、第102位、第106位、第109位、第110位、第112位、第113位、第119位、第124位、第128位、第135位、第138位、第142位、第145位、第149位、第152位、第154位、第155位、第158位、第159位或第168位，或其组合。39.如权利要求37或38所述的多核苷酸，其中所述所编码的OgLuc变体多肽还包括对应于以下中的至少一个的置换：对应于SEQ ID NO:1的F1I、E4K、F6Y、R11Q、Q18H/I/LV、D19N、Q20P、V21L/M、L22F、L27V、S28Y、F31I、Q32 H/L/P、A33N/M、L34M、V36E/M、V38F/I、P40T、Q42H、K43N/R、I44F、V45E、L46Q、S47P、G48R、E49D/G、N50K/S、G51E/R/V、A54I、D55E、V58I、I60V、S66N、G67D/S、F68L/Y/D、Q69H、M70V、L72Q、E74I/K、M75K、I76F/N/V、F77N/Y、H86L/R、I90T/V、L92Q/R、Y94F、G95D/S、T96A、V98F、I99T/V、V102E/M、M106I、Y109F、F110I、R112C、P113H、V119M、K124M、T128A/S、N135D/Y、I138S、L142V、P145Q、L149I、R152H/S、T154S、I155T、V158I、T159I/S或L168F，或其组合。40.如权利要求37或38所述的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述多肽包括以下氨基酸中的至少一个：对应于SEQ ID NO:1的第1位的异亮氨酸、第4位的赖氨酸、第6位的酪氨酸、第11位的谷氨酰胺、第18位的组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸、第19位的天冬酰胺、第20位的脯氨酸、第21位的亮氨酸或蛋氨酸、第22位的苯丙氨酸、第27位的缬氨酸、第28位的酪氨酸、第31位的异亮氨酸、第32位的脯氨酸、组氨酸或亮氨酸、第33位的天冬酰胺或蛋氨酸、第34位的蛋氨酸、第36位的蛋氨酸或谷氨酸、第38位的异亮氨酸或苯丙氨酸、第40位的苏氨酸、第42位的组氨酸、第43位的天冬酰胺或精氨酸、第44位的苯丙氨酸、第45位的谷氨酸、第46位的谷氨酰胺、第47位的脯氨酸、第48位的精氨酸、第49位的天冬氨酸或甘氨酸、第50位的赖氨酸或丝氨酸、第51位的谷氨酸、精氨酸或缬氨酸、第54位的异亮氨酸、第55位的...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·宾科夫斯基，L·P·昂塞尔，M·哈尔，M·B·罗贝斯，M·R·斯莱特，K·V·伍德，M·G·伍德，
申请(专利权)人：普罗梅加公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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