一种微创制作肺纤维化动物模型的方法技术

本发明专利技术公布了一种微创制作肺纤维化动物模型的方法。具体步骤包括：动物麻醉，气管插管，药物灌注。动物麻醉后以斜侧卧位保定，用气管插管装置从口腔经声门插入动物单侧肺并灌注药物。根据动物肺、气管和支气管的解剖结构以及气管给药时气管插管装置停留在一侧肺的深度和位置，药物可大多均匀分布在一侧肺中，也可集中在一侧肺的某个肺叶中。该方法制作过程简便，成功率高，结果稳定可靠，无或极低死亡率，避免了气管切开等其它方法的复杂操作及其对动物造成的外源性损伤或机械阻塞性窒息，在肺纤维化疾病的病因学、病理学、药物筛选、临床诊断和治疗等研究中具有重要的实际应用价值，可广泛推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术专利涉及一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，属于医学动物实验领域。
技术介绍
肺纤维化是一种早期以肺组织炎症，后期以大量成纤维细胞异常增殖转型和细胞外基质大量沉积为主要表现特点的肺间质疾病。多种病因可引起肺纤维化，如特发性肺纤维化（IPF）、结节病、尘肺、过敏性肺炎等。肺纤维化发病率高，其中大部分疾病呈进行性加重，不可逆且致死率高。以IPF为例，据一项美国医疗保险受益人收集到的数据显示：2001到2011年，美国65岁以上老人，每年IPF的发病率平均为93.7例/10万人，患病率在2001年为202.2例/10万人、2011年为494.5例/10万人，发病率保持稳定，但患病率却出现了明显的增长。以尘肺为例，据2015年中国国家卫生部公布数据显示：2014年中国新发尘肺病例26873例，约为2005年新发病例的3倍，占新发职业病的89.66%。截止至2014年底，中国尘肺病累计病例逾77万例。目前，肺纤维化的防治应以预防为主，尚无有效的治疗方法，现有的治疗仅限于非特异性抗炎、免疫抑制剂等，但疗效均不理想。因此构建一种成功率高，结果稳定可靠，无或低死亡率，可广泛推广的肺纤维化动物模型，对该类疾病的病因学、病理学、药物筛选、临床诊断和治疗等研究中具有重要的实际应用价值，可广泛推广。目前利用药物诱导肺纤维化动物模型的给药途径有多种，如气管内给药法、经鼻给药法以及腹腔或静脉注射药物法等。这些方法均存在一些缺点：如经鼻给药法即经鼻腔将药液滴入，此方法操作简单快速、动物死亡率低，但药液不能完全进入肺部，造成药物损失和个体差异，导致模型不稳定且成功率低；腹腔或静脉注射药物法需要多次注射，剂量大，费用高，模型成型时间晚。气管内给药是目前国内外公认的制作肺纤维化模型的成熟方法，其主要方式有三种：雾化给药法、气管切开给药法以及气管插管给药法。雾化给药法需要特殊的给药仪器，实际操作较困难，成功率低；雾化后药物可能会存留在动物的皮肤、粘膜等处，造成定量不准确。气管切开给药法对实验动物造成外源性损伤，增加了实验动物失血过多和感染的风险，操作过于复杂，术后动物死亡率较高。气管插管给药法目前采用的是将动物平放仰卧保定，气管插管经口腔插入声门后给药，药物通过气管进入到双侧肺支气管和肺泡，直接损伤肺泡上皮细胞，肺组织纤维化病变主要分布在支气管、细支气管周围，可以一次或多次给药。但该方法死亡率较高，特别是给药时气管插管的位置较高、给药速度过快时，药物会阻塞气管，导致实验动物因缺氧而窒息。另外，注入气管内的药物会引起实验动物的咳嗽反射，造成药物损失和个体差异。为了克服上述方法的缺点，本专利技术专利在气管插管给药法的基础上提出了一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特点是微创，操作简便快速，成功率高，结果稳定可靠，无或低死亡率，成本低，可广泛推广。
技术实现思路
为克服现有的气管内给药法制作的肺纤维化动物模型损伤大、死亡率高的缺点，本专利技术专利提供了一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，开发一种相对现有技术操作简捷、成功率高、损伤小且成本低廉、易广泛推广的动物气管内给药方法，此方法可建立与人类肺纤维化疾病高度相似的稳定疾病模型，在肺纤维化疾病的病因学、病理学、药物筛选、临床诊断和治疗等研究中具有重要的实际应用价值。本专利技术专利提出了一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，包括以下步骤：（1）动物麻醉；（2）气管插管；（3） 药物灌注。在本专利技术专利一个较佳实施例中，所述气管插管装置为12号灌胃针，长度为10 cm，灌胃针头端约弯曲15°。在本专利技术专利一个较佳实施例中，步骤（3）所述灌注药物为博莱霉素，且博莱霉素剂量为3.0 mg/kg、5.0 mg/kg、7.0 mg/kg。在本专利技术专利一个较佳实施例中，所述动物为各种种系和性别的实验大鼠，大鼠体重为200~250 g。本专利技术专利的优势是：本专利技术专利采用微创气管内灌注药物（如博莱霉素）构建肺纤维化动物模型，该方法制作过程简便快速，减少气管切开等对动物造成的外源性损伤，成功率高，无/低死亡率，可广泛推广，在肺纤维化疾病的病因学、病理学、药物筛选、临床诊断和治疗等研究中具有重要的实际应用价值。附图说明图1为本专利技术专利中动物气管插管及实验操作示意图（以大鼠为例）。如图所示药物灌注时大鼠体位为斜侧卧位，使大鼠一侧肺位于斜上方，另一侧肺位于斜下方。本专利技术专利中气管插管装置从口腔经声门插入气管内并到达右肺下叶次级支气管分叉处。图中1所示为所用气管插管装置（以12号灌胃针为例），2所示为气管插管装置顶端到达右肺下叶次级支气管分叉处。图2为无菌生理盐水和不同剂量的博莱霉素分别灌注大鼠肺后第七日全肺的肺系数对比图（肺系数=肺质量（mg）/体质量（g））。其中NS为无菌生理盐水灌注大鼠肺后第七日大鼠全肺的肺系数，3、5、7为分别使用3 mg/kg、5 mg/kg、7 mg/kg博莱霉素通过多点给药方式诱导大鼠肺纤维化后第七日全肺的肺系数。*表示差异具有统计学意义（P<0.05），**表示差异具有显著统计学意义（P<0.01）。图3为无菌生理盐水和不同剂量的博莱霉素分别灌注大鼠肺后第七日肺的苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining，简称HE染色法）对比图（100倍）。其中A是用无菌生理盐水灌注大鼠肺后第七日右肺的HE染色图，B、C、D为分别使用3 mg/kg、5 mg/kg、7 mg/kg博莱霉素通过多点给药方式诱导大鼠肺纤维化后第七日右肺的HE染色图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术专利的技术方案作进一步详细地说明，所描述的实施例仅是本专利技术专利的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1 建立动物模型的方法以无特定病原体动物级（Specific Pathogen Free，SPF）Sprague-Dawley雄性大鼠为例，提供一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，包括以下步骤：大鼠全身麻醉，如：用舒泰50麻醉剂肌肉注射麻醉动物。（1）首先对大鼠进行体重称量，肌肉注射65 mg/kg舒泰50麻醉剂麻醉大鼠，15~20分钟后，大鼠达到Ⅲ期麻醉，此时会厌的保护性关闭反射消失，肌肉出现松弛。（2）将麻醉后的大鼠以仰卧位保定于呈30~60°倾斜角的操作台上，大鼠上门牙钩挂固定于一半环状金属丝上，在颈下放置一直径约为1.5 cm的圆筒状垫枕，使胸部、颈部与下颌成一条直线。用双手保定住大鼠身体，操作者右手持镊子，轻微夹着大鼠舌头向外上方拉开，使大鼠口腔小幅度张开，左手持12号灌胃针，弯曲端朝上，向上轻压舌尖，沿着舌根部方向，灌胃针顶端紧贴上颚一直向前，插管时要将灌胃针尽量向上腭部方向轻挑，以防插入食道。灌胃针通过声门进入气管时会有轻微的阻力突破感，并在经过大鼠气管环状软骨时有间歇停顿的轻微阻塞感；当灌胃针到达气管和支气管分叉处时，由于大鼠气管、右肺主支气管与右肺下叶次级支气管成一条直线，将灌胃针稍微靠向右肺主支气管继续插入遇阻力时停止，灌胃针即可顺利进入大鼠右肺下叶次级支气管分叉处。（3）根据气管给药时气管插管停留在右肺的深度，药物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征为：动物麻醉，气管插管，药物灌注。

【技术特征摘要】
1.一种微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征为：动物麻醉，气管插管，药物灌注。2.根据权利要求1所述的微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征在于：气管插管的操作和步骤。3.根据权利要求1所述的微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征在于：药物灌注的操作和步骤。4.根据权利要求1-2所述的微创制作肺纤维化动物模型的方法，其特征在于：气管插管装置具有合适的长度、直径和弯度，能够经口腔插入声门达到各种动物一侧支气管；且用于气管插管的...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦德，谭志刚，童迎九，刘学光，
申请(专利权)人：四川欧瑞吉生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51