变构蛋白的从头设计制造技术

用于制备和分离结合至一种或多种变构效应物以诱导所述蛋白质中的构象变化的变构DNA结合蛋白的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请信息本申请要求于2014年2月21日提交的美国临时专利申请61/942,755号的优先权，其通过引用其全文纳入本文用于所有目的。政府权益的声明本专利技术在美国能源部授予的DE-FG02-02ER63445的政府支持下完成。政府享有本专利技术的某些权利。
本专利技术涉及用于设计新型变构蛋白的方法和组合物。背景在合理的蛋白质设计中，利用对于感兴趣的蛋白质的结构和功能的详细了解来构建该蛋白质的突变形式。然而，合理的诱变方法通常不成功，因为复杂且非直观的相互作用常主导蛋白质的结构和功能。因此，需要开发用于蛋白质工程改造的新方法和组合物。专利技术概述本专利技术的实施方式基于用于设计变构蛋白的新方法和组合物，所述变构蛋白通过结合至靶标小分子或变构效应物并经历后续的构象变化来响应靶标小分子或变构效应物。在本专利技术的某些方面中，本文所述的方法和组合物可用于设计有用于工程改造生物合成通路的传感蛋白(sensor protein)，所述生物合成通路有利于，例如，基于发酵的分子生成。在本专利技术的其它方面中，本文所述的方法和组合物可用于设计正交的、可诱导的基因表达系统，所述基因表达系统用于哺乳动物细胞培养中，其相对于本领域技术人员目前采用的方法(例如Tet-On系统)而言是一项显著进步。在本专利技术的其它方面中，本文所述的方法和组合物还可用于设计可诱导的基因表达系统，所述基因表达系统有用于，例如，大规模发酵，其相对于本领域技术人员目前所用的方法(例如基于IPTG的系统)而言是一项显著进步。在某些示例性实施方式中，提供制备和分离变构DNA结合蛋白的方法，所述变构DNA结合蛋白结合至侣伴变构效应物，所述侣伴变构效应物诱导所述变构DNA结合蛋白中的构象变化。本文中所用的术语“变构蛋白”指的是一种蛋白质，其能结合效应物分子并经历构象变化，这造成所述蛋白质的一种或多种活性的增加或减少。本专利技术的变构蛋白可以是传感物(sensor)和/或可诱导的基因表达系统(例如，正交的基因表达系统)的部分。(综述参见Liang等.(2013)Biotech.and Bioeng.110:1419)。变构蛋白(allosteric protein)是本领域技术人员熟知的，并且包括转录因子、核糖开关、双组分信号转导蛋白、核激素受体等。本文中所用的“效应物分子”指的是一种分子，例如，选择性地结合至变构蛋白并调节其生物活性的小分子。由此，效应物分子起到配体的作用，以增加或减少一种或多种活性，包括但不限于，酶促活性、基因表达、细胞信号转导等。在某些方面中，效应物分子增加变构蛋白的活性，即，所述效应物分子作为“变构活化物”起作用。在其它方面中，效应物分子降低变构蛋白的活性，即，所述效应物分子作为“变构抑制剂”起作用。在某些示例性实施方式中，以计算机模拟的方式(in silico)通过计算来设计候选变构DNA结合蛋白，所述候选变构DNA结合蛋白具有针对所需的侣伴变构效应物的结合口袋。提供编码所述候选变构DNA结合蛋白的核酸序列，随后将其引入细菌宿主细胞并表达所述候选变构DNA结合蛋白。在某些示例性实施方式中，采用负选择鉴定其中所述候选变构DNA结合蛋白已结合至DNA并抑制所述基因的表达的第一多个微生物(例如，细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))，来确定所述候选变构DNA结合蛋白是否结合至DNA并抑制基因表达。如果所述DNA结合蛋白结合至DNA并抑制基因表达，则所述微生物(例如，细菌宿主细胞)将存活。不结合至DNA的候选变构DNA结合蛋白会活化所述基因的表达，这造成携带该变构DNA结合蛋白的细菌宿主细胞死亡。在某些示例性实施方式中，采用正选择鉴定其中所述候选变构DNA结合蛋白已结合至所述侣伴变构效应物的第二多个细菌宿主细胞，来确定第一多个细菌宿主细胞中的候选变构DNA结合蛋白是否结合至所需的侣伴变构效应物。将通过正选择，利用所需的变构效应物分子，来分析从第一多个细菌宿主细胞汇集的候选DNA结合蛋白的活性。在正选择中，仅携带响应所需的变构效应物分子的候选DNA结合蛋白的细菌宿主细胞将存活。对所述微生物的基因组任选地进行遗传修饰，以纳入编码针对毒素的解毒物(antidote)的DNA。表达时，变构蛋白调节微生物中解毒物的生成。根据变构蛋白的性质，其可调节解毒生成，通过在不存在变构效应物的情况下遏制，在存在变构效应物的情况下活化，在不存在变构效应物的情况下阻断核糖体结合结合位点等。如果将所述微生物置于毒素环境且无解毒物生成或生成的解毒不足，则所述微生物将死亡。可以外源地提供所需的变构效应物。任选地将微生物置于所述解毒物的毒素对应物的环境中。就此而言，所述解毒物在本文中称为“选择物”，在此意义上，解毒物由细胞响应存在的变构效应物的水平并以足以防止细胞死亡的量生成。与变构效应物成比例的解毒物的水平选择包含候选变构DNA结合蛋白的菌种进行进一步修饰和优化。在本专利技术的某些方面中，负选择包括，使所述细菌宿主细胞与对表达所述基因的细胞具有毒性的毒素接触。在本专利技术的其它方面中，负选择包括：使所述细菌宿主细胞与对细胞具有毒性的毒素接触，所述细胞中，候选变构DNA结合蛋白未结合至DNA来抑制所述基因的表达。在本专利技术的某些方面中，正选择包括，使第一多个细菌宿主细胞与毒素和侣伴变构效应物接触，其中，所述毒素对其中不表达所述基因的细胞具有毒性。在本专利技术的某些方面中，正选择包括，使第一多个细菌宿主细胞与毒素和变构效应物靶标接触，其中，所述毒素对这样的细胞具有毒性：其中所述侣伴变构效应物未以使所述候选变构DNA结合蛋白从DNA释放的方式结合至所述候选变构DNA结合蛋白。在本专利技术的某些方面中，正选择包括，当所述候选变构DNA结合蛋白已经结合至DNA以表达所述基因时，检测在第一多个细菌细胞中表达的可检测的标志物。在本专利技术的某些方面中，可检测的标志物是可(例如通过荧光活化的细胞分选)被检测的荧光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质(GFP))。在本专利技术的某些方面中，变构DNA结合蛋白调节荧光报告物(例如GFP)的表达，从而，在变构DNA结合蛋白被变构效应物分子活化时，表达荧光报告物。在本专利技术的某些方面中，通过荧光活化的细胞分选(FACS)对负选择后的第一多个细胞进行额外筛选。在本专利技术的某些方面中，正向筛选包括，评价候选变构DNA结合蛋白对于所需的变构效应物的活化，其中，通过FACS仅分选并收集通过表达所述荧光报告物报告活化的那些候选变构DNA结合蛋白。在本专利技术的某些方面中，正选择还包括，当侣伴变构效应物未以从DNA释放候选变构DNA结合蛋白的方式结合至候选变构DNA结合蛋白时，检测在第一多个细菌细胞中表达的可检测的标志物。在某些示例性实施方式中，提供制备和分离结合至侣伴变构效应物的变构DNA结合蛋白的方法，其中，所述侣伴变构效应物诱导所述变构DNA结合蛋白中的构象变化。所述方法包括，以计算机模拟的方式通过计算来设计候选变构DNA结合蛋白，其具有针对侣伴变构效应物的结合口袋，和，提供编码所述候选变构DNA结合蛋白的核酸序列。所述方法还包括，将所述核酸序列引入大肠杆菌宿主细胞并表达所述候选变构DNA结合蛋白。所述方法包括，通过采用负本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备和分离变构DNA结合蛋白的方法，所述变构DNA结合蛋白结合至侣伴变构效应物，其诱导构象变化，所述方法包括：以计算机模拟的方式通过计算设计候选变构DNA结合蛋白，其具有针对侣伴变构效应物的结合口袋，提供编码所述候选变构DNA结合蛋白的核酸序列，将所述核酸序列引入细菌宿主细胞，并表达所述候选变构DNA结合蛋白，采用负选择来鉴定其中候选变构DNA结合蛋白已结合至DNA并抑制基因表达的第一多个细菌宿主细胞，从而确定所述候选变构DNA结合蛋白是否结合至DNA并抑制所述基因的表达，和采用正选择来鉴定其中所述候选变构DNA结合蛋白已结合至所述侣伴变构效应物的第二多个细菌宿主细胞，从而确定第一多个细菌宿主细胞中的所述候选变构DNA结合蛋白是否结合至所述侣伴变构效应物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.21 US 61/942,7551.一种制备和分离变构DNA结合蛋白的方法，所述变构DNA结合蛋白结合至侣伴变构效应物，其诱导构象变化，所述方法包括：以计算机模拟的方式通过计算设计候选变构DNA结合蛋白，其具有针对侣伴变构效应物的结合口袋，提供编码所述候选变构DNA结合蛋白的核酸序列，将所述核酸序列引入细菌宿主细胞，并表达所述候选变构DNA结合蛋白，采用负选择来鉴定其中候选变构DNA结合蛋白已结合至DNA并抑制基因表达的第一多个细菌宿主细胞，从而确定所述候选变构DNA结合蛋白是否结合至DNA并抑制所述基因的表达，和采用正选择来鉴定其中所述候选变构DNA结合蛋白已结合至所述侣伴变构效应物的第二多个细菌宿主细胞，从而确定第一多个细菌宿主细胞中的所述候选变构DNA结合蛋白是否结合至所述侣伴变构效应物。2.如权利要求1所述的方法，其中，编码所述候选变构DNA结合蛋白的核酸序列从结合至基质的核酸子序列产生。3.如权利要求2所述的方法，其中，连接来自所述基质的多个子序列，以形成编码所述候选变构DNA结合蛋白的核酸序列。4.如权利要求1所述的方法，其中，所述负选择包括使所述细菌宿主细胞与对表达所述基因的细胞具有毒性的毒素接触。5.如权利要求1所述的方法，其中，所述负选择包括使所述细菌宿主细胞与毒素接触，所述毒素对其中所述候选变构DNA结合蛋白未结合至DNA以抑制所述基因的表达的细胞具有毒性。6.如权利要求1所述的方法，其中，所述正选择包括使第一多个细菌宿主细胞与毒素和所述侣伴变构效应物接触，其中，所述毒素对其中不表达所述基因的细胞具有毒性。7.如权利要求1所述的方法，其中，所述正选择包括使第一多个细菌宿主细胞与毒素和变构效应物靶标接触，其中，所述毒素对如下细胞具有毒性：其中所述侣伴变构效应物未以使所述候选变构DNA结合蛋白从所述DNA释放的方式结合至所述候选变构DNA结合蛋白的细胞。8.如权利要求1所述的方法，其中，所述正选择包括：在所述候选变构DNA结合蛋白已结合至所述DNA以表达所述基因时，检测第一多个细菌细胞中表达的可检测的标志物。9.如权利要求8所述的方法，其中，所述可检测标志物是荧光蛋白。10.如权利要求9所述的方法，其中，所述荧光蛋白通过荧光活化的细胞分选来检测。11.如权利要求7所述的方法，其中，所述正选择还包括，当所述侣伴变构效应物未以使所述候选变构DNA结合蛋白从所述DNA释放的方式结合至所述候选变构DNA结合蛋白时，检测在第一多个细菌细胞中表达的可检测的标志物。12.如权利要求1所述的方法，其中，所述DNA结合蛋白是化学传感物。13.如权利要求1所述的方法，其中，所述细菌宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。14.一种制备和分离变构DNA结合蛋白的方法，所述变构DNA结合蛋白结合至侣伴变构效应物，其诱导构象变化，所述方法包括：以计算机模拟的方式通过计算设计候选变构DNA结合蛋白，其具有针对侣伴变构效应物的结合口袋，提供编码所述候选变构DNA结合蛋白的核酸序列，将所述核酸序列引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主细胞，并表达所述候选变构DNA结合蛋白，采用负选择来鉴定其中候选变构DNA结合蛋白已结合至DNA并抑制基因的表达的第一多个酿酒酵母宿主细胞，从而确定所述候选变构DNA结合蛋白是否结合至DNA并抑制所述基因的表达，和采用正选择来鉴定其中所述候选变构DNA结合蛋白已结合至所述侣伴变构效应物的第二多个酿酒酵母宿主细胞，从而确定第一多个酿酒酵母宿主细胞中的所述候选变构DNA结合蛋白是否结合至所述侣伴变构效应物。15.如权利要求14所述的方法，其中，编码所述候选变构DNA结合蛋白的核酸序列从结合至基质的核酸子序列产生，并且经连接，以形成编码所述候选变构DNA结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·M·丘奇，S·拉曼，N·D·泰勒，
申请(专利权)人：哈佛学院董事及会员团体，
类型：发明
国别省市：美国;US