基于3D打印制备人工神经导管的方法和人工神经导管技术

本发明专利技术公开了一种基于3D打印制备人工神经导管的方法和人工神经导管，解决自体神经移植限制临床应用的问题。使用蚕丝蛋白制备丝素蛋白溶液；制备丝素蛋白微球悬浮液；在丝素蛋白微球中加载生长因子；制备含神经细胞的蚕丝生物墨水；使用加载有生长因子的丝素蛋白微球和PLGA制备复合材料；在3D打印机的第一打印喷头中装入蚕丝生物墨水，第二打印喷头中装入复合材料；先控制第二打印喷头打印人工神经导管的外管，在控制第一打印喷头打印人工神经导管的多个内管，最后进行细胞培养分化形成神经导管。采用三维生物打印制备的神经导管为神经细胞的附着生长提供基体，为神经轴突结合提供了引导，能促进神经再生，取代自体神经移植。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医疗器械
，具体地说，是涉及一种基于3D打印制备人工神经导管的方法和人工神经导管。
技术介绍
周围神经损伤是临床常见的四肢严重创伤的原因。据《科学时报》（2004）报道，在全球每年新增创伤病例中，周围神经损伤病例约占1.5%～4.0%。我国周围神经损伤病例每年新增60万～90万例，其中需要通过神经移植来修复神经的病例约为30万～45万例。周围神经缺损的修复，尤其是长距离缺损的修复，一直是临床上较为棘手的难题。目前最常用的方法是：利用自体次要神经移植、同种异体神经移植、异种异体神经移植等来桥接修复损伤的主要神经断端，促进受损的神经再生，从而达到一定程度的功能恢复。其中，同种异体神经和异种异体神经移植由于存在一定的免疫反应和传染疾病的风险，而免疫抑制剂的应用会造成机体免疫力低下，导致患者继发肿瘤和感染性疾病的发生，临床应用有一定的困难；因此，自体神经移植由于不存在免疫反应和传染疾病的风险而成为目前周围神经外科领域神经修复的金标准。然而，自体神经移植的修复方法也存在一定的缺点：自体神经移植需要手术切取移植的神经，造成神经来源有限。并且，还需要牺牲次要神经的功能，造成供区神经瘤、疤痕的形成及感染的风险等，这些缺点限制了其临床应用。
技术实现思路
本申请提供了一种基于3D打印制备人工神经导管的方法和人工神经导管，解决现有自体神经移植限制临床应用的技术问题。为解决上述技术问题，本申请采用以下技术方案予以实现：提出一种基于3D打印制备人工神经导管的方法，包括如下步骤：步骤1：使用蚕丝蛋白制备丝素蛋白溶液；步骤2：基于步骤1制备的丝素蛋白溶液，制备丝素蛋白微球悬浮液；步骤3：在丝素蛋白微球中加载生长因子；步骤4、制备含神经细胞的蚕丝生物墨水；步骤5：使用步骤3制备的加载有生长因子的丝素蛋白微球和PLGA制备复合材料；步骤6：在3D打印机的第一打印喷头中装入步骤4制备的蚕丝生物墨水，在3D打印机的第二打印喷头中装入步骤5制备的复合材料；先控制所述第二打印喷头打印人工神经导管的外管，然后控制所述第一打印喷头打印人工神经导管的多个内管；步骤7：将3D打印的人工神经导管进行细胞培养分化形成神经导管。进一步的，所述步骤1，具体为：将蚕丝蛋白放置于碳酸钠溶液中脱胶并烘干；用溴化锂水溶液溶解烘干的蚕丝蛋白；将溶解有烘干蚕丝蛋白的溴化锂水溶液透析处理，通过离子交换去除溶液中的溴化锂，离心后获得再生丝素水溶液；将所述再生丝素水溶液置于烘箱中缓慢浓缩，并置于4℃储存。进一步的，所述步骤2，具体为：将步骤1制备的丝素蛋白溶液与PEG溶液混合并搅拌，搅拌同时滴加乳化剂；将所述丝素蛋白溶液、PEG溶液和乳化剂的混合溶液冷冻48h；将冷冻的混合溶液在室温下融化得到乳白色溶液；将所述乳白色溶液离心，弃掉上清液后，用去离子水洗涤三次，超声后再次离心，弃掉沉淀得到分散性良好的丝素蛋白微球悬浮液；所述PEG溶液的质量体积比为10%-30%，所述丝素蛋白溶液与所述PEG溶液的共混溶液在20℃温度下以100rpm的转速搅拌1分钟；所述乳化剂为Tween-20、Tween-40、Tween-60和/或Tween-80；所述乳化剂与所述丝素蛋白和PEG的混合溶液的体积比为1:3-3:1；所述乳白色溶液以8000rmp的速度离心15分钟；超声时长为15分钟；再次离心的转速为500rmp，时长为15分钟。进一步的，所述步骤3，具体为：将所述丝素蛋白微球悬浮液置于1毫升的浓度为15微克/毫升的生长因子溶液中，在4℃下孵育24h后，以12000r/min的速度离心3分钟，获取上清液；其中，所述生长因子为NGF、NT-3、NT-4和/或BDNF。进一步的，所述步骤4，具体为：在磷酸盐缓冲液中加入明胶，搅拌溶解；在搅拌溶解的磷酸盐缓冲液中加入琼脂、蚕丝蛋白溶液、多元醇溶液、神经细胞、载有生长因子的丝素蛋白微球悬浮液，顺时针搅拌至均匀，放置于5℃环境下保存备用；其中，所述神经细胞为雪旺细胞、神经干细胞和/或嗅鞘细胞；所述多元醇溶液为乙二醇溶液、丙三醇溶液和/或丁四醇溶液；所述明胶含量为10%-30%；所述蚕丝蛋白溶液的含量为30%-50%；所述多元醇溶液的含量为0.5%-2%；所述琼脂含量为10%-30%；；所述载有生长因子的丝素蛋白微球悬浮液的含量为1%-5%。进一步的，所述步骤5，具体为：将步骤3制备的加载有生长因子的丝素蛋白溶液在室温下浇筑成丝素蛋白膜；使用共溶剂将所述丝素蛋白膜与PLGA材料溶解在一起，并在室温下浇筑成复合膜；将所述复合膜在室温下干燥，除去共溶剂，并置于真空干燥箱中抽真空干燥，使共溶剂完全挥发，然后置于4℃环境下备用；其中，所述共溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和/或六氟异丙醇；加载有生长因子的丝素蛋白与PLGA的质量配比为1:10-10:1。进一步的，所述人工神经导管的外管打印的直径为2mm-10mm，长度为20mm-40mm；所述人工神经导管的内管的个数为多个，每个内管的打印直径为0.1mm-10mm，长度为10mm-30mm；所述外管和所述内管均为多孔结构，孔隙大小为100-300微米。进一步的，所述步骤1中，所述脱胶过程具体包括：将蚕丝蛋白放入浓度为4.24g/L的碳酸钠水溶液中搅拌煮沸10-50min，然后用去离子水清洗干净；所述溴化锂水溶液的浓度为9.5±0.3mol/L；所述透析处理包括：将所述溶解有蚕丝蛋白的溴化锂水溶液用截留分子量为3500的透析袋浸在去离子水中透析3天，期间每两小时换一次去离子水；所述再生丝素水溶液置于烘箱中缓慢浓缩的浓缩条件为60℃，容器表面用带有小孔的保鲜膜覆盖，缓慢浓缩24h后取出，浓度为10%-30%。提出一种人工神经导管，包括外管和多个位于所述外管内的内管；由基于3D打印制备人工神经导管的方法制备。所述基于3D打印制备人工神经导管的方法，包括如下步骤：步骤1：使用蚕丝蛋白制备丝素蛋白溶液；步骤2：基于步骤1制备的丝素蛋白溶液，制备丝素蛋白微球悬浮液；步骤3：在丝素蛋白微球中加载生长因子；步骤4、制备含神经细胞的蚕丝生物墨水；步骤5：使用步骤3制备的加载有生长因子的丝素蛋白微球和PLGA制备复合材料；步骤6：在3D打印机的第一打印喷头中装入步骤4制备的蚕丝生物墨水，在3D打印机的第二打印喷头中装入步骤5制备的复合材料；先控制所述第二打印喷头打印人工神经导管的外管，然后控制所述第一打印喷头打印人工神经导管的多个内管；步骤7：将3D打印的人工神经导管进行细胞培养分化形成神经导管。与现有技术相比，本申请的优点和积极效果是：本申请提出的基于3D打印制备人工神经导管的方法和人工神经导管，采用三维生物打印技术制备具有统一孔径、管中管结构的人工神经导管，外管在三维空间内沿纵向排列形成套管，套管的外部直径可根据实际需要调整，形成一体化的仿生结构更有利于促进神经再生；外管内部为多根中空的内管，内管为神经细胞的附着生长提供了基体，同时为神经轴突结合提供了引导作用，从而加快神经细胞再生速率。外管和内管打印使用不同的打印材料，都具有一定的机械性能，且所用的材料均利于细胞增殖与生长，无毒性，组织相容性良好；内管降解速度较快，不会对神经的再生造成阻碍，外管的降解周期长，可以为再生神经提供力学支撑，本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于3D打印制备人工神经导管的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：使用蚕丝蛋白制备丝素蛋白溶液；步骤2：基于步骤1制备的丝素蛋白溶液，制备丝素蛋白微球悬浮液；步骤3：在丝素蛋白微球中加载生长因子；步骤4、制备含神经细胞的蚕丝生物墨水；步骤5：使用步骤3制备的加载有生长因子的丝素蛋白微球和PLGA制备复合材料；步骤6：在3D打印机的第一打印喷头中装入步骤4制备的蚕丝生物墨水，在3D打印机的第二打印喷头中装入步骤5制备的复合材料；先控制所述第二打印喷头打印人工神经导管的外管，然后控制所述第一打印喷头打印人工神经导管的多个内管；步骤7：将3D打印的人工神经导管进行细胞培养分化形成神经导管。

【技术特征摘要】
1.基于3D打印制备人工神经导管的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：使用蚕丝蛋白制备丝素蛋白溶液；步骤2：基于步骤1制备的丝素蛋白溶液，制备丝素蛋白微球悬浮液；步骤3：在丝素蛋白微球中加载生长因子；步骤4、制备含神经细胞的蚕丝生物墨水；步骤5：使用步骤3制备的加载有生长因子的丝素蛋白微球和PLGA制备复合材料；步骤6：在3D打印机的第一打印喷头中装入步骤4制备的蚕丝生物墨水，在3D打印机的第二打印喷头中装入步骤5制备的复合材料；先控制所述第二打印喷头打印人工神经导管的外管，然后控制所述第一打印喷头打印人工神经导管的多个内管；步骤7：将3D打印的人工神经导管进行细胞培养分化形成神经导管。2.根据权利要求1所述的基于3D打印制备人工神经导管的方法，其特征在于，所述步骤1，具体为：将蚕丝蛋白放置于碳酸钠溶液中脱胶并烘干；用溴化锂水溶液溶解烘干的蚕丝蛋白；将溶解有烘干蚕丝蛋白的溴化锂水溶液透析处理，通过离子交换去除溶液中的溴化锂，离心后获得再生丝素水溶液；将所述再生丝素水溶液置于烘箱中缓慢浓缩，并置于4℃储存。3.根据权利要求1所述的基于3D打印制备人工神经导管的方法，其特征在于，所述步骤2，具体为：将步骤1制备的丝素蛋白溶液与PEG溶液混合并搅拌，搅拌同时滴加乳化剂；将所述丝素蛋白溶液、PEG溶液和乳化剂的混合溶液冷冻48h；将冷冻的混合溶液在室温下融化得到乳白色溶液；将所述乳白色溶液离心，弃掉上清液后，用去离子水洗涤三次，超声后再次离心，弃掉沉淀得到分散性良好的丝素蛋白微球悬浮液；所述PEG溶液的质量体积比为10%-30%，所述丝素蛋白溶液与所述PEG溶液的共混溶液在20℃温度下以100rpm的转速搅拌1分钟；所述乳化剂为Tween-20、Tween-40、Tween-60和/或Tween-80；所述乳化剂与所述丝素蛋白和PEG的混合溶液的体积比为1:3-3:1；所述乳白色溶液以8000rmp的速度离心15分钟；超声时长为15分钟；再次离心的转速为500rmp，时长为15分钟。4.根据权利要求1所述的基于3D打印制备人工神经导管的方法，其特征在于，所述步骤3，具体为：将所述丝素蛋白微球悬浮液置于1毫升的浓度为15微克/毫升的生长因子溶液中，在4℃下孵育24h后，以12000r/min的速度离心3分钟，获取上清液；其中，所述生长因子为NGF、NT-3、NT-4和/或BDNF。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红，韩芳芳，王克响，
申请(专利权)人：青岛三帝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37