一种脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法技术

本发明专利技术涉及一种脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，属种子处理技术领域。具体通过以下步骤完成：（1）湿热处理，（2）药剂处理，（3）滤种，（4）漂洗，（5）烘干，（6）病毒检测。该方法克服了现有技术的不足，利用本发明专利技术提供的方法不仅提高了辣椒种子的发芽率及发芽势，而且对辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的脱除更为彻底，脱除率达到100%。另外本发明专利技术提供的一种可对脱毒效果进行评价的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，能够精确掌握脱毒种子中病毒的含量，从而在保证种子高品质的前提下，准确控制钝化病毒的技术指标，做到最大限度地抑制病毒活性。本发明专利技术提供的辣椒种子脱毒方法不受时间限制、环境的影响，可常年在实验室或基层单位使用，非常实用，可用于脱毒辣椒种子的规模化生产。

Method for removing pepper mild mottle virus in pepper seeds

The invention relates to a method for removing pepper mottle virus in pepper seeds. The steps are as follows: (1) heat and moisture treatment, (2) medicament treatment, (3) filter, (4) rinsing, (5) drying, (2) virus detection. This method overcomes the shortcomings of the prior art, the method provided by the invention can not only improve the germination rate and germination potential of pepper seeds, and removal of pepper mild mottle virus in pepper seeds is more thoroughly, the removal rate reached 100%. An evaluation of the effect of detoxification by real-time fluorescent quantitative PCR TaqMan probe detection method is also provided by the invention can accurately grasp the content of de virus in seeds, and under the premise of ensuring high quality seeds, technical index of accurate control of inactivation, achieve maximum inhibition of virus activity. The method provided by the present invention is not limited by time and environment, and can be used in laboratory or basic unit all the year round.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及种子处理
，具体涉及一种脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法。
技术介绍
辣椒是我国播种面积第二大的蔬菜作物，年栽培面积约133万hm2。病毒病是危害辣椒生产的重要病害，造成辣椒减产20%-70%，品质变劣，成为制约辣椒产业发展的重要障碍。辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus, PMMoV）为世界性流行病毒，该病毒最早在美国发现，我国自1994年首次在新疆辣椒产区发现以来，传播地区不断扩大，危害逐步加重，目前在陕西、北京、宁夏、山东青岛、河北保定等地陆续发现，传播地区进一步扩大，危害逐步加重。PMMoV主要危害辣椒果实，引起椒果变小、畸形、凸凹斑驳甚至坏死、易脱落，严重影响辣椒的产量和品质。PMMoV为典型的种传病毒，种子带毒率可达90.0%，即使少量的带毒种子也会作为初侵染毒源，由汁液摩擦、接触等方式二次传染造成病害的快速流行和危害，防治难度大；同时还随种质资源交流远距离传播扩散，对病毒病的发生、传播、危害影响极大。因此对种子进行脱毒和无害化处理，从源头上杜绝病原，是有效控制和预防辣椒病毒病大发生，从而减少经济损失的重要环节。研究表明，采用干热处理、温汤浸种、辐照、化学药剂等种子处理技术能在一定程度上脱除、钝化种子携带的病毒，有效降低种子带毒率。目前对辣椒种子中的黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）所研发的脱毒处理的研究和应用有见报道，但未见针对辣椒种子中PMMoV的脱毒方法。由于不同病毒的致死温度、致死时间等生物学特性不同，不同植物种子对高温、化学药剂等的耐受性均有较大差异，种子脱毒处理工艺直接影响脱毒效果、种子质量及寿命，操作稍有不慎，会导致种子发芽率和发芽势降低，或失去活力。因此在种子脱毒处理中，如何精确控制钝化病毒的技术指标，做到既能最大限度地保证种子脱毒效果彻底持久，同时又能使种子保持高活力，以降低风险、确保生产安全，是一个亟待解决的难题。建立高效、灵敏的病毒检测方法，制定安全高效的种子脱毒技术指标是解决这一难题的关键。目前常用的种子脱毒效果的检测方法主要有苗期症状观察、指示植物法、酶联免疫法、免疫电镜法和RT-PCR技术，这些方法虽然能够对脱毒效果进行评价，但存在着稳定性差、只能定性检测、灵敏度有限等缺点，不能对病毒进行精确定量，难以确定种子脱毒处理措施对病毒数量和活性的影响，因此无法精确控制钝化病毒的技术指标，难以避免病毒脱除效果不佳，或种子中的病毒虽被脱除，但种子的品质却严重下降的现象。近年发展起来的TaqMan探针实时荧光PCR技术，与上述检测方法相比，该法具有更加灵敏、简便、高效、稳定和定量化等优点。尤其是其可定量的特点应用于种子脱毒效果的检测中，能够精确掌握脱毒种子中病毒的含量，从而在保证种子高品质的前提下，准确控制钝化病毒的技术指标，做到最大限度地抑制病毒活性。目前尚未见利用TaqMan探针实时荧光PCR技术进行辣椒种子脱毒效果评价的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对辣椒种子中携带的主要病毒PMMoV，提供一种辣椒种子高效、安全脱毒的方法和一种可对脱毒效果进行评价的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，做到既能最大限度地抑制病毒活性，又不降低种子的发芽和活力，为辣椒病毒病的防治和无毒种苗的繁育提供技术支持。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是：针对辣椒种子携带的主要病毒PMMoV，提供一种辣椒种子脱毒方法，具体步骤如下：1. 湿热处理：将辣椒种子浸泡于5倍体积的沸水中，并迅速震荡冷却至40-45 ℃，滤干水溶液；2. 药剂处理：在滤干水溶液的辣椒种子中加入5倍体积的10%Na3PO4溶液，浸泡35 min；3. 滤种：药剂处理结束后，过滤种子，滤去10%Na3PO4溶液；4. 漂洗：用无菌水清洗辣椒种子3-5次，滤干无菌水；5. 烘干：及时将步骤4中得到的种子放于网架上置于烘箱内，40℃处理72h，防止种子发芽及霉变；6. 病毒检测：利用TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对步骤5获得的种子进行病毒检测，并根据PCR扩增曲线Ct值和标准曲线方程即可对辣椒种子中的PMMoV进行精确定量，计算脱毒率。具体包括如下步骤：（1）提取辣椒种子总RNA随机选取10粒脱毒处理的种子和10粒未脱毒处理的种子，各为1份，分别在液氮中研磨至粉末，采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA。抽提RNA产物加入DEPC-ddH2O溶解，-70 ℃保存备用。（2）cDNA的合成以提取的待测辣椒种子总RNA为模板，反转录制备cDNA模板。反转录体系为20 µL包括：RNA模板2 µL，10 mmol/L的dNTPs 2 µL，10 µmol/L的随机引物2  µL，10×RT mix 2 µL，Quant Reverse Transcriptase 2 µL，RNase-free ddH2O 10 µL。反应条件：37 ℃，60 min。（3）实时荧光定量PCR检测以合成的cDNA为模板，利用PMMoV特异性引物对：PMMoV-F:5’-TTAGATTTCCTGCTACTGGTTTCAA-3’；PMMoV-R:5’-CAGTTGTAGGATTTTGCGGATTT-3’及TaqMan探针：PMMoV-Probe: 5’-FAM-TGTCGGCACTTCTCGGAGCCTTTG-TAMRA-3’进行实时荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR检测体系为20 µL：包括2×Master Mix（Probe）10 µL，10 µmol/L的上游引物PMMoV-F 0.6 µL、10 µmol/L的下游引物PMMoV-R 0.6 µL，10 µmol/L的TaqMan探针PMMoV-Probe 0.4 µL，模板1 µL，补足灭菌ddH2O至20 µL。荧光定量PCR检测反应程序为：50 ℃预处理2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火、延伸1 min，循环40次；60 ℃收集荧光。（4）带毒量检测反应结束后记录各检测样品的PCR扩增曲线Ct值，通过建立的PMMoV实时荧光定量PCR反应的标准曲线方程：y=-2.9204x+43.526，x为所测样品中PMMoV目标基因片段拷贝数的对数，y为Ct值，计算出检测样品中PMMoV的基因片段拷贝浓度，从而对辣椒种子中PMMoV含量进行定量检测。（5）计算种子脱毒率种子脱毒率（%）=（1-处理后种子的带毒量/未处理种子带毒量）×100。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术提供的辣椒种子脱毒方法与现有方法相比，本专利技术解决了既能最大限度地抑制病毒活性，又不降低种子的发芽和活力这一难题。利用本专利技术提供的方法不仅提高了辣椒种子的发芽率及发芽势，而且对辣椒种子中PMMoV的脱除更为彻底，脱除率达到100%。2、与传统的田间指示植物检测相比，本专利技术提供的实时荧光定量PCR检测方法大大缩短了，检测时间，传统的方法需要几个月甚至1年的时间才能完成，而本专利技术只需要几个小时即可完成脱毒效果检测。3、与目前常用的指示植物法、血清学技术、RT-PCR检测方法相比，本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于通过以下步骤实现：（1）湿热处理：将辣椒种子浸泡于5倍体积的沸水中，并迅速震荡冷却至40‑45 ℃，滤干水溶液；（2）药剂处理：在滤干水溶液的辣椒种子中加入5倍体积的10%Na3PO4溶液，浸泡35 min；（3）滤种：药剂处理结束后，过滤种子，滤去10%Na3PO4溶液；（4）漂洗：用无菌水清洗辣椒种子3‑5次，滤干无菌水；（5）烘干：及时将步骤4中得到的种子放于网架上置于烘箱内，40 ℃处理72 h，防止种子发芽及霉变；（6）病毒检测：利用TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对步骤5获得的种子进行病毒检测，并根据PCR扩增曲线Ct值和标准曲线方程即可对辣椒种子中的辣椒轻斑驳病毒进行精确定量，计算脱毒率。

【技术特征摘要】
1.一种脱除辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的方法，其特征在于通过以下步骤实现：（1）湿热处理：将辣椒种子浸泡于5倍体积的沸水中，并迅速震荡冷却至40-45 ℃，滤干水溶液；（2）药剂处理：在滤干水溶液的辣椒种子中加入5倍体积的10%Na3PO4溶液，浸泡35 min；（3）滤种：药剂处理结束后，过滤种子，滤去10%Na3PO4溶液；（4）漂洗：用无菌水清洗辣椒种子3-5次，滤干无菌水；（5）烘干：及时将步骤4中得到的种子放于网架上置于烘箱内，40 ℃处理72 h，防止种子发芽及霉变；（6）病毒检测：利用TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对步骤5获得的种子进行病毒检测，并根据PCR扩增曲线Ct值和标准曲线方程即可对辣椒种子中的辣椒轻斑驳病毒进行精确定量，计算脱毒率。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的病毒检测具体步骤如下：（1）提取辣椒种子总RNA：随机选取10粒脱毒处理的种子和10粒未脱毒处理的种子，各为1份，分别在液氮中研磨至粉末，采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，抽提RNA产物加入DEPC-ddH2O溶解，-70 ℃保存备用；（2）cDNA的合成：以提取的待测辣椒种子总RNA为模板，反转录制备cDNA模板，反转录体系为20 µL包括：RNA模板2 µL，10 mmol/L的dNTPs 2 µL，10 µmol/L的随机引物2 µL，10×RT mix 2 µL，Quant Reverse Transcriptase 2 µL，RNase-free ddH2O 10  µL；反应条件：3...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗明，韩剑，张强，赵冰梅，张祥林，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65