一株来自猪场废弃物的极端嗜热细菌制造技术

本发明专利技术公开了一株来自猪场废弃物的极端嗜热细菌。经过富集培养、初筛、复筛等获得该菌，经革兰氏染色可知，为革兰氏阳性短杆菌，菌体单个或成对排列，芽胞近圆形，近端生，孢囊膨大。通过此菌株的性能检测，显示，此菌株能高效降解含病死畜禽的养殖场废弃物为有机肥，即无烟、无臭、无污水排放，又能实现有机废弃物的循环利用，从而减少畜禽养殖对环境造成的污染，是一个符合绿色环保、保证食品安全的技术。

An extremely thermophilic bacterium from swine waste

The invention discloses an extremely thermophilic bacterium from a pig farm waste. After enrichment culture, screening, screening and so on to obtain the bacteria, Gram staining can be seen as a gram positive short bacilli, single or paired arrangement of bacteria, spores near the circle, near the end of the birth, cyst expansion. Through the performance test, the strain showed that this strain can degrade farm waste containing dead livestock for organic fertilizer, which is smokeless, odorless, no sewage discharge, and can realize the organic waste recycling, thereby reducing the environmental pollution caused by livestock and poultry breeding, is a green environmental protection, to ensure food safety the technology.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及工业微生物领域，更具体的说，是涉及一株来自猪场废弃物的极端嗜热细菌及应用。
技术介绍
嗜热菌(俗称高温菌,也称嗜热微生物),是一类生活在高温环境中的微生物, 广泛分布在温泉、堆肥、地热区土壤、火山地区以及海底火山地等。在美国黄石国家公园的含硫热泉中,曾经分离到一株嗜热的兼性自养细菌——酸热硫化叶菌( Sulfolobus) ,它们可以在高于90℃的温度下生长。嗜热细菌并非单一的菌属或菌群,而是广泛分布于各种不同的菌群中,其中有些嗜热细菌,其同届菌中皆为嗜热菌,如红色嗜热杆菌( Rhodothermus) 、脱硫肠状菌(Desu1. fotomaeulum) 、玫瑰弯菌( Roseiflexus) 、嗜热好氧杆菌( Thermoaerobium) 、嗜热厌氧杆菌( Thermoanaerobaeterium) 、嗜热嗜油杆菌( Thermoleophilum) 、绿弯菌(Ctdorolfexus) 、嗜热丝菌( Thermothrix) 、嗜热管菌( Thermosipho) 、球杆菌(Sphaembaeter) 等,也有高温菌及中温菌并存的菌属。如芽孢杆菌、奇异球菌(Deincooccus) 、假黄色单胞菌( Pseudoxanthomonas) 等。嗜热菌是一种生活在高温环境下的微生物,根据它们的耐热程度,可把嗜热菌分为五个不同的类群 :耐热菌、兼性嗜热菌、专性嗜热菌、极端嗜热菌和超嗜热菌。极端嗜热菌:最高生长温度高于70℃,最适温度高于65℃,最低生长温度高于40℃。到目前为止,已陆续发现多种嗜热微生物能产生热稳定的木聚糖酶, 主要是Thermotoga属的一些种,其中热稳定性较好的是从Thermotoga sp. FiSS3 - B. 1、Thermotoganeapolitana、Thermotoga maritime 和Thermotogathermarum分离的酶, 它们的稳定性在80-105℃。畜禽养殖场废弃物特别病死畜禽的处理是老大难的问题，不仅给环保增加压力，而且制约畜牧业的发展。因此筛选能高效降解含病死畜禽的养殖场废弃物的微生物具有极大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供一株自猪场废弃物的极端嗜热细菌。所述细菌为热噬淀粉芽孢杆菌（Bacillus thermoamylovorans）HL8103 ，已于2016年6月15日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏号为CGMCC No.12613，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的细菌在降解畜禽养殖场废弃物中的应用。培养基： (1) LB培养液(L) ：酵母浸粉10g，蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，NaCl10g，pH7.2，加蒸馏水定容至1L制成。（2）分离纯化固体培养基：LB培养液中时加入20g琼脂粉。（3）液体发酵培养基：酵母浸粉10g，蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，NaCl10g，pH7.2，加蒸馏水定容至1L制成。分离筛选： (1) 富集培养：从猪场废弃物较中心处取样品0.5g，加入盛有50mL LB培养基的250mL 锥形瓶中，在60℃、120r/min 条件下富集培养24h，将2mL 培养物接种到新鲜的LB培养基，以相同的条件进行培养。如此重复3 次。 (2) 初筛：富集培养物在分离纯化固体培养基上划线培养，60℃培养24h。挑取生长明显的菌落进行复筛。 (3) 复筛：将初筛菌落在分离纯化固体培养基上划线分离3 次，以获得纯培养物，并依据菌种在分离纯化固体培养基的生长情况，挑选生长旺盛的菌株。 (4)极端嗜热细菌的生长性能的测定：在容积为250mL 的锥形瓶中，加入LB培养液100mL，接种1mL 菌悬液(OD =1)，在150r/min 条件下，分别进行不同的pH和温度的培养，测定其最佳的生长条件。结论：本专利技术分离筛选得到的极端嗜热细菌在LB培养基70℃培养20h,菌落圆形、白色，凸起，表面光滑、湿润、边缘整齐。本专利技术分离筛选得到的极端嗜热细菌，属热噬淀粉芽胞杆菌，革兰氏阳性，该菌株形态特征为：菌体杆状，直或弯曲，0.3-0.5μm×1.6-6.0μm,单个或成对排列，芽胞近圆形，近端生，孢囊膨大。经检测，该极端嗜热细菌可以耐受90℃的高温，且最适生长温度为70℃，最适生长pH值为6.8-7.3。本专利技术的优点是：由于该极端嗜热细菌可以耐受90℃的高温，因而可以很方便地通过控制温度进而控制氧浓度，降低生产工艺和设备要求；可以在很简单的发酵设备（如无防杂菌污染装置）中，利用含病死畜禽的养殖场废弃物作为碳氮源生长；降低设备投入及发酵底物成本；还可以通过提高温度杀死其他非耐高温细菌，从而保证目标菌体单一性。附图说明图1为HL8103菌落自然光下形态图。图2为HL8103菌电镜下菌株形态图。图3 为HL8103基于16S rDNA基因序列以Neighbor-Joining 法构建的系统发育树。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术详细说明。实施例1工艺流程：采集样品→样品预处理→富集培养→选定耐高温菌株→生长性能的测定→最佳生长pH 值的测定→最佳生长温度的测定→细菌的形态观察→获得HL8103菌株。本专利技术极端嗜热细菌的分离筛选方法，是采用梯度增温分离方法筛选得到的，其方法包括如下步骤：采集样品：采集猪场和生猪屠宰场废弃物堆积较中心处取品；样品预处理：取上述样品装入已灭菌并盛装有无菌水的容器中，密封后剧烈震摇10min，静置悬浮液，取上清液离心3min 后，取上层菌液为菌悬液，备用；富集培养：分别取菌悬液10μL 接种于250mL LB 培养液中，置于50℃恒温箱中培养震荡48h，得扩大菌种培养液；逐级梯升温筛选：取10μL 扩大菌种培养液接种于250mL LB 培养液中，按温度逐级递升进行培养，即后一温阶所用接种菌液取自前一温阶培养的菌液；选定耐高温菌：在培养温度下，观察接种菌液后的LB 培养液，如出现浑浊，则判定该菌可在此温度下生长，反之则排除；选定耐高温菌株：取耐50℃以上的菌液，以生理盐水稀释（10-3），并均匀涂布于LB培养基内，70℃培养20h ；挑取有不同形态特征的单菌落，于70℃LB培养基上分别扩繁后，以完全营养液体培养基加20%甘油混匀，于-80℃条件下保存；最佳生长pH 值的测定：配制不同pH值的LB培养液，各取50mL 分装到容积250mL 的锥形瓶中，接种0.5mL菌悬液，70℃、150r/min 条件下培养20h，以LB培养液作空白，在波长540nm处测定菌悬液的光密度。最佳生长温度的测定：将pH7.2 的LB培养液50ml 置于250mL 锥形瓶中，接种0.5mL 菌悬液，分别在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃条件下培养20h，在波长540nm 处测定其光密度值。所述的培养震荡的震荡频率为150r/min。实施例2 ：本专利技术的极端嗜热细菌的鉴定方法，包括以下步骤：（1）观察极端嗜热细菌的菌落形态和菌株形态，本专利技术极端嗜热细菌在LB培养基70℃培养20h,菌落形态特征为：圆形、白色，凸起，表面光滑、湿润、边缘整齐。（图1）本专利技术极端嗜热细菌，属热噬淀粉芽胞杆菌，革兰氏阳性，该菌株形态特征为：菌体杆状，直或弯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株来自猪场废弃物的极端嗜热细菌，其特征在于: 所述细菌为热噬淀粉芽孢杆菌（Bacillus thermoamylovorans）HL8103 ，已于2016年6月15日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏号为CGMCC No.12613。

【技术特征摘要】
1. 一株来自猪场废弃物的极端嗜热细菌，其特征在于: 所述细菌为热噬淀粉芽孢杆菌（Bacillus thermoamylovorans）HL8103 ，已...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪伏荣，刘景，董志岩，李忠荣，叶鼎承，邱华玲，方桂友，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35