一种酶法制备红景天苷的方法技术

本发明专利技术提供了一种酶法制备红景天苷的方法。具体是以氯化胆碱和甘油加热搅拌合成的低共熔溶剂(DES)作为反应溶剂，采用β‑D‑葡萄糖苷酶生物催化糖基化合成红景天苷，底物(葡萄糖计)转化率可达30％以上。本发明专利技术所采用的DES绿色无毒，对于反应底物溶解度较高，且具有良好的生物相容性。本发明专利技术制备方法具有操作简单，高效环保，条件温和，成本低廉等优点。

Method for preparing salidroside by enzyme method

The invention provides a method for preparing salidroside by enzyme method. In particular to choline chloride and glycerol synthesis heating stirring eutectic solvent (DES) as a reaction solvent, using D beta glucosidase catalyzed glycosylation synthesis of salidroside, substrate (glucose) conversion rate can reach more than 30%. The DES used by the invention has the advantages of no toxicity, high solubility and good biocompatibility. The preparation method has the advantages of simple operation, high efficiency, environmental protection, mild condition, low cost, etc..

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及合成红景天苷的方法，具体是一种酶法制备红景天苷的方法。
技术介绍
红景天(Rhodiola rosea L.)，多年生草本植物，生长在海拔1800-2500米高寒无污染地带，其生长环境恶劣，因而具有很强的生命力和特殊的适应性。可作药用，能够补气清肺，益智养心，是一味作用广泛的中药；亦有很大的美容效果，可作护肤品，也可食用。红景天苷(Salidroside)，分子式C14H20O7，结构式：是红景天中的主要有效成分，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射和延缓机体衰老、防止老年疾病的功能，在军事医学、航天医学、运动医学和保健医学等方面具有十分重要的应用价值，是一种极具开发前景的环境适应药物，近年来备受关注。植物体中红景天苷含量低，经过多步分离纯化后得率很低，且野生红景天由于过度采挖资源匮乏，不耐高温无法人工大面积栽培，因而限制了从天然植物中大量提取的可行性，目前主要通过愈伤组织悬浮培养和化学合成的方法获取红景天苷。以上获取方法主要缺点为产物浓度低、纯度低，成本较高以及反应时间较长，因而难以投入实际应用。化学合成红景天苷大多都需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂，而生物合成具有反应条件温和，立体选择性高，反应过程简单，环境污染少等特点，在合成红景天苷方面显示了一定的优越性。虽然前期已有相关研究工作成功进行糖苷类化合物的酶催化生物合成(Tong et al.,2004；KatSumi et al.,2004；Hiroyuki Akita et al.,2006)，但由于β-D-葡萄糖苷酶本质上属于糖苷水解酶类，在传统水相中因受水解-糖基化反应热力学平衡的限制而导致反应转化率低下，红景天苷浓度较低，成为酶催化合成糖苷类化合物的一大瓶颈。因此，以传统有机溶剂作为共反应介质成为近年来酶催化生物合成的一大研究热点。尽管如此，但在红景天苷生物合成反应中，由于酶、底物以及产物均难溶于有机溶剂，且酶的活性和稳定性较差，因此并不利于反应的进行，对于合成结果并没有太大改善作用。因此，选择一类合适的反应介质得以解决上述困难，是实现红景天苷高效合成的关键所在。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对酶催化生物合成红景天苷的现有技术中存在的问题，提供一种合成简单、成本低廉、环境友好的酶法制备红景天苷的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术将低共熔溶剂(DES)体系用于β-D-葡萄糖苷酶催化糖基化合成红景天苷，反应过程操作简单，条件温和，实现了高效环保合成的宗旨。本专利技术反应路线：本专利技术提供的一种酶法制备红景天苷的方法，包括以下步骤：(1)将氢键供体化合物和氢键受体化合物按摩尔比1:0.5-3均匀混合，在80-100℃加热搅拌至形成均一透明液体，P2O5干燥两周，得到低共熔溶剂(DES)；所述的氢键受体化合物为季铵盐或两性离子化合物，氢键供体化合物为多元醇。(2)按摩尔比1:5-10取无水D-葡萄糖和酪醇，充分溶解于以pH 4.0-7.0缓冲液配制的体积含量为70-90％的DES水溶液中，制得50mM D-葡萄糖和250-500mM酪醇的底物溶液，再按30-60U/mL加入45℃预先孵育的壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，混合均匀，加热至40-70℃，保温、搅拌反应96-120h，反应结束后，过滤，制得含有红景天苷的滤液。用去离子水清洗过滤出的壳聚糖固定化的β-D葡萄糖苷酶微球，重复三次，4℃条件保存，可重复利用。所述步骤(1)中的季铵盐优选为氯化胆碱，多元醇优选为甘油。所述步骤(2)中的缓冲液为乙酸-乙酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液中的任一种，优选为0.1M pH5.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。所述步骤(2)中葡萄糖与酪醇的摩尔比优选为1:10。所述步骤(2)中体系中DES体积含量优选为80％。所述步骤(2)中反应温度优选为40-50℃。所述步骤(2)中壳聚糖微球固定化的β-葡萄糖苷酶用量优选为35-50U/mL。所述步骤(2)中壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，通过如下方法制得：将壳聚糖溶解于稀冰乙酸中，制得5mg/mL壳聚糖胶体溶液，超声驱除气泡，进一步制成1.5mm左右大小的干燥微球，加至3％戊二醛溶液中，50℃下震荡交联2h，洗去多余戊二醛后，加入β-D葡萄糖苷酶液，25℃、150rpm条件下震荡吸附24h，用pH5.8柠檬酸-磷酸盐缓冲液洗去固定化酶表面的游离酶，4℃保存备用。与现有技术相比本专利技术的有益效果：本专利技术采用的低共熔溶剂(DES)是一类廉价易得、原子经济，可循环使用的新型绿色溶剂，具有低挥发性、无毒性、可设计性以及生物降解性高等优点，是一种新颖的绿色环保溶剂，在酶催化生物转化领域有着广阔的应用前景。在β-D葡萄糖苷酶催化合成红景天苷反应中，DES对于极性底物葡萄糖以及中极性底物酪醇均具有良好的溶解性，保持了酶的较高催化活性，并且酶的热稳定性也得到提高，这些因素保障了酶的长时间反应的活力，并且可重复利用。最佳工艺条件下，红景天苷酶催化合成反应中底物的转化率可达38.2％，平行试验三次，RSD为3.46％。该工艺条件较温和，且高效简便，重复性良好。附图说明图1实施例1合成产物HPLC图谱图2实施例2合成产物HPLC图谱具体实施方式为更好地理解本专利技术，下面结合实施例对本专利技术作进一步地说明，本专利技术要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。实施例1A.低共熔溶剂的合成：准确称取13.97g氯化胆碱，量取14.56mL甘油，混合加入500mL圆底烧瓶中，于集热式磁力搅拌器中加热搅拌，温度为80-100℃，转速为300rpm。反应10h后，形成均一透明液体，制得约30mL DES。B.壳聚糖微球固定化β-D葡萄糖苷酶制备：称取0.5g壳聚糖溶解于100mL 2％冰乙酸中，制得壳聚糖胶体溶液，超声驱除气泡。用注射器吸取适量上述壳聚糖溶液，滴至凝结液中，凝结液组成为7.5％NaOH溶液/95％乙醇(v/v)＝4:1，形成1.5mm左右大小的微球，经干燥后，加入到3％戊二醛溶液中，50℃下震荡交联2h，洗去多余戊二醛，加入β-D葡萄糖苷酶液，25℃下震荡吸附24h(150rpm)。用0.1M pH5.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液洗去固定化酶表面的游离酶，4℃保存备用。C.酶催化合成红景天苷：分别准确称取无水D-葡萄糖1.8g，酪醇13.82g，搅拌使充分溶解于160mL DES中，再依次加入45℃预先孵育的40mL pH5.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，8000U壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，混合均匀。将上述体系加热至50℃，保温、搅拌反应120h，反应结束后，过滤出反应液，以等体积甲醇稀释，经HPLC检测底物(葡萄糖计)转化率达38.2％。实施例2A.同实施例1。B.同实施例1。C.酶催化合成红景天苷：分别准确称取无水D-葡萄糖1.8g，酪醇11.06g，搅拌使充分溶解于180mL DES中，再依次加入45℃预先孵育的20mL pH5.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，10000U壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，混合均匀。将上述体系加热至45℃，保温、搅拌反应120h，反应结束后，过滤出反应液，以等体积甲醇稀释，经HPLC检测底物(葡萄糖计)转化率达32本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将氢键供体化合物和氢键受体化合物按摩尔比1:0.5‑3均匀混合，在80‑100℃加热搅拌至形成均一透明液体，P2O5干燥两周，得到低共熔溶剂(DES)；所述的氢键受体化合物为季铵盐或两性离子化合物，氢键供体化合物为多元醇；(2)按摩尔比1:5‑10取无水D‑葡萄糖和酪醇，充分溶解于以pH 4.0‑7.0缓冲液配制的体积含量为70‑90％的DES水溶液中，制得50mM D‑葡萄糖和250‑500mM酪醇的底物溶液，再按30‑60U/mL加入45℃预先孵育的壳聚糖微球固定化的β‑D葡萄糖苷酶，混合均匀，加热至40‑70℃，保温、搅拌反应96‑120h，反应结束后，过滤，制得含有红景天苷的滤液。

【技术特征摘要】
1.一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将氢键供体化合物和氢键受体化合物按摩尔比1:0.5-3均匀混合，在80-100℃加热搅拌至形成均一透明液体，P2O5干燥两周，得到低共熔溶剂(DES)；所述的氢键受体化合物为季铵盐或两性离子化合物，氢键供体化合物为多元醇；(2)按摩尔比1:5-10取无水D-葡萄糖和酪醇，充分溶解于以pH 4.0-7.0缓冲液配制的体积含量为70-90％的DES水溶液中，制得50mM D-葡萄糖和250-500mM酪醇的底物溶液，再按30-60U/mL加入45℃预先孵育的壳聚糖微球固定化的β-D葡萄糖苷酶，混合均匀，加热至40-70℃，保温、搅拌反应96-120h，反应结束后，过滤，制得含有红景天苷的滤液。2.如权利要求1所述的一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的季铵盐为氯化胆碱，多元醇为甘油。3.如权利要求1所述的一种酶法制备红景天苷的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的缓冲液为乙酸-乙酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液和柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液中的任一种。4.如权利要求3所述的一种酶法制备红景天苷的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立伟，程启斌，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14