可诱导型c-myc过表达的转基因载体、转基因小鼠模型及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种可诱导型c‑myc过表达的转基因载体、转基因工具小鼠及其构建方法，c‑myc编码区与pcDNA3载体连接获得pcDNA3‑c‑myc质粒；Loxp‑Stop‑Loxp片段与pcDNA3‑c‑myc质粒连接获得pcDNA3‑Loxp‑Stop‑Loxp‑c‑myc质粒；EF1a启动子片段与pcDNA3‑Loxp‑Stop‑Loxp‑c‑myc质粒连接获得转基因载体，再以该转基因载体为基础构建转基因小鼠模型。本发明专利技术构建得到的转基因小鼠模型为可诱导的白血病模型，在没有诱导剂的情况下c‑myc不表达不发病，在诱导剂作用的情况下c‑myc过表达，引发白血病的发生，较常规的转基因小鼠模型具有更好的可控性，可根据实验需要调整需维持的种群数量。

Over expression of inducible c myc transgenic vector, transgenic mice model and its construction method

The invention discloses a transgenic vector, overexpression of inducible c myc transgenic tool mouse and its construction method, c myc encoding region and pcDNA3 pcDNA3 C vector plasmid myc; Loxp Stop Loxp fragment and pcDNA3 c myc plasmid pcDNA3 Loxp Stop connection Loxp c myc plasmid; EF1a promoter fragment and pcDNA3 Loxp Stop Loxp c myc plasmid transgenic vector, then the transgenic vector to construct transgenic mouse model. The invention constructs a transgenic mouse model of the leukemia model can induce, in the absence of inducers of C expression of Myc disease, overexpression of the inducer under the action of c myc, lead to the occurrence of leukemia, transgenic mouse model which has better controllability, according to the experiment need to adjust to maintain the population.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，更具体地，本专利技术涉及一种在造血系统中可诱导型c-myc转基因载体及其构建方法、以及在造血系统中可诱导型c-myc转基因小鼠模型及其构建方法。
技术介绍
白血病是一类发生于造血器官，以血液和骨髓中的白细胞及其前体细胞的增殖和发育异常为特征的恶性疾病。根据世界卫生组织的报告，2000年全球约有21万人死于白血病，其中90％为成年人。小鼠造血系统的特点与人类类似，小鼠白血病与人类白血病在许多方面极为相似。小鼠白血病模型的研究和开发已成为研究人类白血病发病机制、生化免疫特征、病理生理改变、细胞和分子生物学特性及进行实验治疗的有力工具，具有重要意义。近年研究表明，白血病的发生与细胞原癌基因的激活和抑癌基因的缺失或突变有着密切的关系。其中原癌基因c-myc是目前研究最为广泛的癌基因之一，该基因属于myc原癌基因家族成员之一(c-Myc,N-myc and L-myc)。Myc蛋白为basic-helix-loop-helix zipper(bHLHZ)类转录因子，其可以与Max形成异二聚体结合到特异的CAC(G/A)TG‘E-box’序列，通过与各种其他因子相结合调控大量靶基因的表达。Myc被认为参与最基本的细胞活动过程，如增殖，生长，分化和凋亡等，在胚胎发育和肿瘤发生过程中发挥重要作用。在造血系统中，c-myc基因不仅在造血细胞生成的各个阶段起调节作用，其表达异常与血液系统疾病的发生，特别是各类型白血病的发生密切相关。研究表明，几乎在所有的男性Burkitt’s B细胞淋巴瘤病例中均可发现因染色体重排导致的c-myc基因组成型表达；在急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病中，虽未发现c-myc基因的易位，但仍可发现通过其他染色体重排、对c-myc异常的磷酸化修饰、c-myc上游正调控基因异常激活等引发的c-myc基因功能上的过表达；在慢性粒细胞白血病整个发病过程中，均可发现因c-myc上游调控激酶bcr/abl的表达引发的c-myc的过表达，并且发现c-myc的mRNA水平随着慢性粒细胞白血病的进展过程，从慢性期、加速期至急性变期不断升高；最近的研究表明c-myc的泛素化调节在慢性髓系白血病的起始和发展过程中发挥重要作用。C-myc转基因小鼠的研究表明：受Ig重链增强子驱动的c-myc基因在B淋巴细胞中的高表达可导致淋巴瘤和早期B细胞白血病的发生。该转基因小鼠模型已经作为自发性白血病的经典模型，广泛应用于白血病发病机制，相关药物筛选等研究。通过病毒感染在骨髓细胞中过表达c-myc的研究表明，骨髓细胞过表达c-myc可导致急性髓性白血病的发生。这些证据表明c-myc基因在多种类型白血病的发生、发展过程中发挥重要作用。该基因相关转基因模型的建立，模拟了人类白血病的发生过程，促进了对c-myc基因功能的了解，加速了对白血病药物的研发进程。然而，这些模型也有其局限性：以Ig重链增强子驱动的c-myc转基因小鼠(Eμ-myc)为例，c-myc的过表达始于胚胎期，出生后小鼠中即可观察到B细胞体积增大等白血病症状，阻碍了对于c-myc导致的白血病发生过程中myc基因功能的了解，在该转基因小鼠模型中，myc从早期持续的高表达导致Eμ-myc转基因小鼠的平均寿命只有12周，在研究过程中需要维持大量的种群。综上所述，由于目前常用的c-myc转基因白血病小鼠模型具有c-myc持续高表达，发病时间不可控等缺陷，迫切需要建立一种可诱导的自发的白血病转基因模型。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种在造血系统中可诱导型c-myc过表达的转基因载体、小鼠模型及其构建方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种可诱导型c-myc过表达转基因载体的构建方法，包括以下步骤：A、以包含c-myc ORF cDNA质粒为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，PCR扩增获得序列号为SEQ ID No:3的c-myc编码区，XhoI和XbaI酶切c-myc编码区和pcDNA3载体，连接获得pcDNA3-c-myc质粒；B、以包含Loxp-Stop-Loxp元件的质粒为模板，SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物，PCR扩增获得序列号为SEQ ID No:6的Loxp-Stop-Loxp片段，EcoRI和NotI酶切Loxp-Stop-Loxp片段和pcDNA3-c-myc质粒，连接获得pcDNA3-Loxp-Stop-Loxp-c-myc质粒；C、以pLVX-EF1a-ires-puro质粒为模板，SEQ ID No:7和SEQ ID No:8为引物，PCR扩增获得序列号为SEQ ID No:9的EF1a启动子片段，BamHI和EcoRI酶切EF1a启动子片段和pcDNA3-Loxp-Stop-Loxp-c-myc质粒，连接获得可诱导型c-myc过表达转基因载体。本专利技术还提供了上述构建方法构建得到的可诱导型c-myc过表达转基因载体。本专利技术还提供了一种可诱导型c-myc过表达转基因小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：(1)、SmaI和PvuI酶切上述可诱导型c-myc过表达转基因载体，凝胶回收包含EF1a promoter-Loxp-Stop-Loxp-c-myc的片段，受精卵供体雌鼠超排卵后雌鼠雄鼠合笼，将见栓的雌鼠处死收集处于单细胞期的受精卵，进行雄原核显微注射；将正常发育为两细胞的受精卵移植到假孕雌鼠子宫，假孕雌鼠所生小鼠即为转基因F0代小鼠；(2)、将上述转基因F0代小鼠与野生型小鼠交配，传代建系，获得F1代小鼠；选择在骨髓、脾脏、淋巴结以及胸腺均高表达的F1代小鼠作为后续的实验品系，获得转基因工具小鼠；(3)、将步骤(2)获得的转基因工具小鼠与Cre转基因小鼠交配,获得可诱导c-myc过表达的转基因工具小鼠。本专利技术还提供了上述构建方法构建得到的可诱导型c-myc过表达转基因小鼠模型。本专利技术还提供了上述可诱导型c-myc过表达转基因载体和可诱导型c-myc过表达转基因小鼠模型在抗白血病药物筛选中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术构建得到的转基因小鼠模型为可诱导的白血病模型，在没有诱导剂的情况下c-myc不表达不发病，在诱导剂作用的情况下c-myc过表达，引发白血病的发生，较常规的转基因小鼠模型具有更好的可控性，可根据实验需要调整需维持的种群数量；2、本专利技术建立的白血病转基因小鼠模型通过控制给予诱导剂的时间，控制c-myc的过表达时机，从而控制白血病的发病时间，研究c-myc在白血病发病不同时期的功能；以该模型为基础建立动物整体水平的白血病动物模型，为筛选针对不同时期白血病的药物提供了支持；本专利技术建立的白血病小鼠模型为自发型的白血病模型，较肿瘤细胞移植模型等更能模拟体内的发病状况；3、本专利技术建立的药物筛选模型，以c-myc原癌基因为靶点，该基因与多种类型的白血病的发生、发展密切相关，为白血病药物筛选提供了新的选择。附图说明图1为本专利技术实施例1中构建的可诱导型c-myc基因过表达的转基因载体的结构图；图2为本专利技术实施例2构建的可诱导型c-myc基因过表达的转基因小鼠模型的功能图。具体实施方式以下结合附图和具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可诱导型c‑myc过表达的转基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A、以包含c‑myc ORF cDNA质粒为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，PCR扩增获得序列号为SEQ ID No:3的c‑myc编码区，XhoI和XbaI酶切c‑myc编码区和pcDNA3载体，连接获得pcDNA3‑c‑myc质粒；B、以包含Loxp‑Stop‑Loxp元件的质粒为模板，SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物，PCR扩增获得序列号为SEQ ID No:6的Loxp‑Stop‑Loxp片段，EcoRI和NotI酶切Loxp‑Stop‑Loxp片段和pcDNA3‑c‑myc质粒，连接获得pcDNA3‑Loxp‑Stop‑Loxp‑c‑myc质粒；C、以pLVX‑EF1a‑ires‑puro质粒为模板，SEQ ID No:7和SEQ ID No:8为引物，PCR扩增获得序列号为SEQ ID No:9的EF1a启动子片段，BamHI和EcoRI酶切EF1a启动子片段和pcDNA3‑Loxp‑Stop‑Loxp‑c‑myc质粒，连接获得可诱导型c‑myc过表达转基因载体。...

【技术特征摘要】
1.一种可诱导型c-myc过表达的转基因载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A、以包含c-myc ORF cDNA质粒为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，PCR扩增获得序列号为SEQ ID No:3的c-myc编码区，XhoI和XbaI酶切c-myc编码区和pcDNA3载体，连接获得pcDNA3-c-myc质粒；B、以包含Loxp-Stop-Loxp元件的质粒为模板，SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物，PCR扩增获得序列号为SEQ ID No:6的Loxp-Stop-Loxp片段，EcoRI和NotI酶切Loxp-Stop-Loxp片段和pcDNA3-c-myc质粒，连接获得pcDNA3-Loxp-Stop-Loxp-c-myc质粒；C、以pLVX-EF1a-ires-puro质粒为模板，SEQ ID No:7和SEQ ID No:8为引物，PCR扩增获得序列号为SEQ ID No:9的EF1a启动子片段，BamHI和EcoRI酶切EF1a启动子片段和pcDNA3-Loxp-Stop-Loxp-c-myc质粒，连接获得可诱导型c-myc过表达转基因载...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈懿建，
申请(专利权)人：赣南医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：江西;36