本发明专利技术属于生物技术和医学技术领域，提供了一种miR‑182、let‑7c在制备乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒中的应用，试剂盒含有miR‑182的定量RT‑PCR引物。本发明专利技术提供的试剂盒，提供一种了新的血清微RNA提取试剂，通过检测miR‑182、let‑7c的表达，可以对乳腺癌进行早期诊断，为肿瘤的诊断提供新的思路。
Diagnostic kit for breast cancer occurrence or metastasis
The invention belongs to the field of biotechnology and medical technology, a miR 182, let 7C in preparation of breast cancer metastasis or diagnostic kit application provides a kit containing miR 182 quantitative RT PCR primer. The kit of the invention provides a new serum micro RNA extraction reagent, through the detection of expression of miR 182, let 7C, can be used in early diagnosis of breast cancer, and provide a new way for the diagnosis of tumor.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和基因诊断学领域，具体涉及血清let-7c及miR-182对乳腺癌发生或转移诊断的应用。
技术介绍
乳腺癌是最常见的家族性肿瘤，是导致世界各地的妇女较高死亡率的原因之一。在中国，死于乳腺癌的患者逐年增加。乳腺癌通常起源于乳导管或小叶乳腺组织，占所有女性癌症(不包括非黑色素瘤皮肤癌)的22.9％。然而，约50％-80％的乳腺癌患者发病的危险因素不明确，因此寻找有效的乳腺癌发病的危险因素或诊断标记物，将有利于乳腺癌诊断和治疗。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子RNA，长度约为22bp核苷酸的非编码RNA。miRNA通过在转录后水平调控基因的表达，参与不同的细胞过程，包括细胞凋亡、造血细胞的分化、物质代谢、神经系统的发育和细胞迁移等过程。许多miRNA参与了人类许多肿瘤的发生发展过程。到目前为止，有许多研究报道了miRNA在乳腺癌细胞株和原发乳腺癌组织的表达情况。例如在乳腺癌细胞中高度表达miR-191/425基因簇，能改变乳腺癌细胞的基因表达谱，参与乳腺癌的侵袭浸润，影响乳腺癌的进展。通过分析的乳腺癌组织miR-21的表达，高度表达miR-21的患者预后存活率明显低于低表达miR-21的乳腺癌患者，表明miR-21参与了乳腺癌的发病进展过程；过表达miR-21还可以增强乳腺癌细胞MCF-7细胞生长、迁移和侵袭能力，增加自我更新和克隆形成能力。过表达miR-200a可阻止乳腺癌细胞发生凋亡，并促进肿瘤细胞转移，同时抑制miR-200a表达可诱发乳腺癌细胞发生凋亡。降低miR-200f的表达会增加EMT相关因子的表达，miR-200f可作为乳腺癌EMT过程的生物标志物。作为一种肿瘤抑制基因，LET-7通过调节雌激素受体(ER)α介导的信号，能抑制ER阳性的乳腺癌干细胞的生长和增殖。这些研究表明，miRNA参与了乳腺癌的发生、迁移和浸润等过程。凋亡和坏死的原发肿瘤可以将其内部的miRNAs排入到血液循环，这类miRNA称为循环miRNA。因此，血液中的miRNA来自许多组织的细胞(包括肿瘤细胞)，这使我们可以分析血液中的miRNA，分析不同器官、组织或细胞的特征。此外，循环的miRNA还具有抗RNase活性，因此在血清和血浆中非常稳定。由于循环miRNA在个人血清中稳定，使得血清miRNA作为有吸引力的生物标志物，其血清水平可用来帮助诊断乳腺癌。至目前为止，有关循环miRNA在乳腺癌患者外周血的表达研究报道不多。为了寻找乳腺癌患者血清miRNA的生物标志物，我们探讨了血清miR-182水平在乳腺癌患者诊断中的价值。在本专利技术之前，miRNA与人类乳腺癌之间的关系已被广泛研究。miRNA的表达变化参与乳腺癌的发生和进展过程。已研究部分miRNA在乳腺癌患者与健康对照血清或血浆的表达，提示其在乳腺癌诊断中的价值。但检测miRNA的方法复杂，研究所需要的试剂盒昂贵。本专利技术旨在创立一种新的血清miRNA诊断方法，设计特异性诊断miR-182、let-7c的诊断试剂，证明它们在乳腺癌诊断中的价值，为肿瘤的诊断提供新的思路。
技术实现思路
本专利技术提供了一种miR-182、let-7c在制备乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒中的应用，还提供一种乳腺癌发生或转移试剂盒，试剂盒含有miR-182的定量RT-PCR引物，所述引物分别为：上游引物序列：GGCAATGGTAGAACTCACAC；下游引物序列：ACATGTACAGTCCATGGATG。试剂盒含有let-7c的定量RT-PCR引物，所述引物分别为：上游引物序列：GTTGAGGTAGTAGGTTGTATGG；下游引物序列：AACATGTACAGTCCATGGATG。本专利技术提供的试剂盒通过检测miR-182、let-7c的表达，可以对乳腺癌进行早期诊断，为肿瘤的诊断提供新的思路。本专利技术还提供一种了新的血清微RNA提取方法。本专利技术公开一种乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒，试剂盒含有miR-182、let-7c的特异性诊断试剂。所述试剂盒含有miR-182的定量RT-PCR引物，引物分别为：上游引物序列：GGCAATGGTAGAACTCACAC下游引物序列：ACATGTACAGTCCATGGATG所述试剂盒含有let-7c的定量RT-PCR引物，所述引物分别为：上游引物序列：GTTGAGGTAGTAGGTTGTATGG下游引物序列：AACATGTACAGTCCATGGATG在试剂盒中进行定量RT-PCR检测血清miR-182、let-7c的表达。所述定量RT-PCR检测血清miR-182、let-7c的表达时加入血清微RNA。所述血清微RNA由以下步骤提取并检测：⑴血清的常规制备将乳腺癌患者血液及对照血液盛于离心管，静置于37℃环境中凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心，得到的上清液即为血清，吸上清，分装备用；⑵血清微RNA的提取取450-550μL血清于1.5mL EP管中，加入等体积苯酚混匀2min，迅速于冰上静置2min，13000rpm离心3min。收集上清液至新EP管，加入与上清等体积的苯酚，重复该操作二次。收集上清液于新EP管，加入与上清等体积的氯仿异戊醇(24：1)，震荡混匀2min，迅速于冰上静置1min，离心13000rpm，3min，重复该操作一次。吸上清层至新的EP管中，加入1/10体积3mol/L，pH＝5.2乙酸钠、等体积100％冰乙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min以上，将该混合液13000rpm，离心3min，去上清，加入750μL的0.1％的DEPC。将上述混合液13000rpm，离心3min，去上清，适度干燥沉淀，用15μL的0.1％的DEPC溶解RNA沉淀，获得RNA样品；⑶血清微RNA的检测取2μL上述RNA样品，加98μL超纯水稀释至100μL，混匀。用超纯水调零，稀释过的RNA移入比色杯，在紫外分光光度计测量，根据OD260/OD280比值判断RNA质量，计算RNA浓度。取2μLRNA样品，加入1μL 6×loading buffer混匀，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，80v电泳10min。所述试剂盒还包括定量RT-PCR反应常用的酶和试剂。附图说明图1：血清微RNA电泳图；图2：乳腺癌患者及对照血清miR-182的表达检测；图3：ROC曲线图。下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步具体说明。具体实施方式以下以血清miR-182检测为例，证明了其在乳腺癌诊断中的价值，为本专利技术作进一步的阐述。这些实例是针对于本专利技术所作的说明，而不是对本专利技术的限制。本专利技术中，以上所述和以下的实施例中，所使用的技术，包括血清制备、微RNA的提取、PCR扩增与检测等分子生物学技术，以及统计分析等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂、软件等，除非是本说明书特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。实施例1血清的常规制备获得患者及对照的非抗凝血液2mL，盛于离心管或可以离心的器皿中，静置或置37℃环境中促其凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心(一般为3000rpm，离心5-10min)，得到的上清液即为血清，可小心将上清吸出(注意切勿吸出细胞成分)，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒含有miR‑182、let‑7c的特异性诊断试剂。
【技术特征摘要】
1.一种乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒含有miR-182、let-7c的特异性诊断试剂。2.根据权利要求1所述的一种乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒含有miR-182的定量RT-PCR引物，所述引物分别为：上游引物序列：GGCAATGGTAGAACTCACAC，下游引物序列：ACATGTACAGTCCATGGATG。3.根据权利要求1所述的一种乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒，其特征在于，试剂盒含有let-7c的定量RT-PCR引物，所述引物分别为：上游引物序列：GTTGAGGTAGTAGGTTGTATGG，下游引物序列：AACATGTACAGTCCATGGATG。4.根据权利要求1所述的一种乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒，其特征在于，在试剂盒中进行定量RT-PCR检测血清miR-182、let-7c的表达。5.根据权利要求4所述的一种乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒，其特征在于，所述血清微RNA由以下试剂及步骤提取并检测：⑴血清的常规制备将乳腺癌患者血液及对照血液盛于离心管，静置于37℃环境中凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心，得到的上清液即为血清，吸上清，分装备用；(2)血清微RNA的提取取450-550μL血清于1.5mL EP管中，加入等体...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢书阳，李有杰，王萍玉，李新新，谢宁，阎云飞，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：山东;37
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