从核酸的初始集合中耗尽靶分子的方法、以及用于实践其的组合物和试剂盒技术

本发明专利技术提供的是从核酸的初始集合中耗尽靶核酸的方法。方法的方面包括以足以从初始集合中耗尽靶核酸的方式，使初始集合与对于靶核酸特异性的核酸引导的核酸酶接触。取决于给定应用，靶核酸的耗尽可不同，例如其中耗尽可包括切割核酸的初始集合中的靶核酸，或从核酸的初始集合中选择性分离靶核酸。本发明专利技术还提供的是用于实践方法的实施例的组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】与相关申请的交叉参考根据35U.S.C.§119(e)，本专利申请要求于2014年2月13日提交的美国临时专利申请序列号61/939,658，以及于2014年8月22日提交的美国临时专利申请序列号62/040,804的提交日期的优先权；所述专利申请的公开内容以引用的方式并入本文。
技术介绍
生物医学研究中的应用通常涉及其他序列的复杂混合物中存在的特异性核酸子集的分析-例如，通过阵列杂交、qPCR或大规模平行测序的基因表达分析。如果目的核酸序列是已知的，则使用特异性引物序列的PCR可用于从混合物中扩增出所需序列。然而，在一些情况下，可能期望分析多重不同序列，可能在序列信息并非完全已知时。例如，真核生物系统中的信使RNA可使用寡核苷酸-dT引物共同扩增且分析，以通过在聚A尾部上引发来起始第一链cDNA合成，由此减少或避免被不需要的核酸-例如核糖体RNA、线粒体RNA和基因组DNA污染。然而，这种方法的要求在于RNA是完整且未降解的，例如聚A尾部未丢失或与RNA信使本体切断。不幸的是，许多本来有用和有利的生物样本-例如作为福尔马林固定和石蜡包埋的组织样品(FFPE样品)保留的活组织检查材料通常受累于此类降解，使得寡核苷酸-dT引发对于此类样品不实际。此外，许多有利的RNA序列没有聚A尾部-例如非编码RNA和非真核生物RNA。在此类情况下，随机引发可用于一般扩增样品中的所有核苷酸种类。然而，随机引发还导致潜在不需要的序列-例如基因组DNA或核糖体RNA的扩增。
技术实现思路
本专利技术提供的是从核酸的初始集合(collection)中耗尽靶核酸的方法。方法的方面包括以足以从初始集合中耗尽靶核酸的方式，使初始集合与对于靶核酸特异性的核酸引导的核酸酶接触。取决于给定应用，靶核酸的耗尽可不同，例如其中耗尽可包括切割核酸的初始集合中的靶核酸，或从核酸的初始集合中选择性分离靶核酸。本专利技术还提供的是用于实践方法的实施例的组合物和试剂盒。附图说明图1示意性举例说明了在本公开内容的某些实施例中有用的核酸引导的核酸酶。图2示意性举例说明了根据本公开内容的一个实施例，用于产生核酸引导组分的方法。图3显示了在图2中示意性举例说明的方法中有用的三种示例寡核苷酸。图4显示了通过凝胶电泳显现的模板核酸的图像。根据本公开内容的一个实施例，模板核酸在通过体外转录产生核酸引导组分中有用。图5显示了通过凝胶电泳显现的核酸的图像。图像证实根据本公开内容的一个实施例，使用核酸引导的核酸酶的靶核酸切割。图6显示了通过凝胶电泳显现的核酸的图像。图像证实根据本公开内容的一个实施例，使用核酸引导的核酸酶的两种不同靶核酸的同时切割。图7提供了根据本公开内容的一个实施例，证实使用核酸引导的核酸酶，用于下一代测序的核酸文库中的靶核酸(在本实例中为18S rRNA)耗尽的数据。小图A显示了指示使用一种或两种示例核酸引导的核酸酶的靶核酸耗尽量的条形图。小图B显示了根据本公开内容的一个实施例，使用渐增量的核酸酶的靶核酸耗尽量。在本实例中，采用核酸引导的核酸酶库(pool)，其中该库包括单一类型的核酸酶组分和不同种类的具有不同核苷酸序列的核酸引导组分。图8提供了根据本公开内容的一个实施例，证实使用核酸引导的核酸酶的靶核酸耗尽的数据。在本实例中，采用核酸引导的核酸酶库，其中该库包括单一类型的核酸酶组分和不同种类的具有不同核苷酸序列的核酸引导组分。图9是使用根据本公开内容的一个实施例的方法，显示测序结果且证实从测序文库中耗尽靶核酸的效应的条形图。图10提供了根据本公开内容的一个实施例，证实使用核酸引导的核酸酶的靶核酸切割的数据。小图A显示了根据本公开内容的一个实施例，证实示例核酸酶组分的纯化的凝胶图像。小图B显示了使用包括小图A中所示的核酸酶组分的核酸引导的核酸酶，证实靶核酸的切割的凝胶图像。图11显示了根据本公开内容的一个实施例，使用不同量的核酸引导的核酸酶，证实靶核酸的切割的凝胶图像。图12提供了证实加上6xHN标签的Cas9的D10A/H840A突变体的表达和纯化的数据(小图A)，以及使用与核酸引导组分库组合的突变体从核酸的初始集合中取出靶核酸且产生富含靶核酸的核酸样品的原理证明(小图B)。具体实施方式本专利技术提供的是从核酸的初始集合中耗尽靶核酸的方法。方法的方面包括以足以从初始集合中耗尽靶核酸的方式，使初始集合与对于靶核酸特异性的核酸引导的核酸酶接触。取决于给定应用，靶核酸的耗尽可不同，例如其中耗尽可包括切割核酸的初始集合中的靶核酸，或从核酸的初始集合中选择性分离靶核酸。本专利技术还提供的是用于实践方法的实施例的组合物和试剂盒。在更详细地描述本公开内容的方法和试剂盒之前，应理解方法和试剂盒并不限于所述的特定实施例，因为这些当然可改变。还应理解本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不预期是限制性的，因为方法和试剂盒的范围仅受所附权利要求限制。当提供值范围时，应理解除非上下文另有明确说明，否则在该范围的上限和下限之间至下限单位十分之一的每个介入值以及该所述范围内的任何其他陈述或介入值，都涵盖在方法和试剂盒内。这些更小范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也涵盖在方法和试剂盒内，经历所述范围内的任何具体排除的限度。当所述范围包括限度之一或两者时，排除那些所包括限度中的任一或两者的范围也包括在方法和试剂盒中。某些范围在本文中由术语“约”在前的数值呈现。术语“约”在本文中用于提供它在其之前的确切数目的字面支持，以及接近或近似该术语在其之前的数目的数目。在测定数目是否接近或近似特定叙述数目中，接近或近似未叙述数目可为这样的数目，在其中呈现它的上下文中，所述数目提供了特定叙述数目的实质等价物。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与方法所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管目前描述了代表性举例说明性方法和材料，但与本文描述的那些相似或等价的任何方法和试剂盒也可用于方法和试剂盒的实践或测试中。本说明书中引用的所有出版物和专利均以引用的方式并入本文，如同每个个别出版物或专利特别且个别指出以引用的方式并入，并且以引用的方式并入本文以公开且描述出版物与其结合引用的方法、试剂盒和/或材料。任何出版物的引用均用于在提交日期前的其公开内容，并且不应解释为承认本文方法和试剂盒由于在先专利技术而无权早于这种出版物。此外，所提供的出版日期可不同于实际出版日期，所述实际出版日期可能需要独立证实。如本文和所附权利要求中使用的，应注意到单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。还注意到权利要求可拟定为排除任何任选元件。像这样，这种陈述预期充当与请求保护的元件叙述结合的排他性术语例如“单独地”、“唯一”等等的使用，或“负”限制的使用的先行基础。应了解为了明确起见，在分开实施例的上下文中描述的方法和试剂盒的某些特征还可在单个实施例中组合提供。相反，为了简短起见，在单个实施例的上下文中描述的试剂盒和方法的各种特征也可分开或以任何合适的亚组合提供。所有实施例组合均由本专利技术具体包含且在本文中公开，正如每个和每一个组合个别且特别公开，至此类组合包含可操作过程和/或装置/系统/试剂盒的程度。另外，描述此类变量的实施例中列出的所有亚组合也由本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从核酸的初始集合中选择性耗尽靶核酸的方法，所述方法包括：以足以从所述初始集合中耗尽所述靶核酸的方式，使所述核酸集合与对于所述靶核酸特异性的核酸引导的核酸酶接触。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.13 US 61/939,658;2014.08.22 US 62/040,8041.一种从核酸的初始集合中选择性耗尽靶核酸的方法，所述方法包括：以足以从所述初始集合中耗尽所述靶核酸的方式，使所述核酸集合与对于所述靶核酸特异性的核酸引导的核酸酶接触。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶核酸是双链核酸。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶核酸是单链核酸。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核酸引导的核酸酶包含RNA引导组分和核酸酶组分。6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核酸引导的核酸酶包含DNA引导组分和核酸酶组分。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使复合物与产物组合物的其他组成成分分离。8.根据权利要求7...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁·艾伦·法莫，克雷格·贝茨，
申请(专利权)人：宝生物工程美国有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US