一种枯草芽孢杆菌对数期表达系统技术方案

本发明专利技术公开了一种枯草芽孢杆菌对数期表达系统，属于基因工程领域。本发明专利技术的表达系统包括一种作为宿主的枯草芽孢杆菌和一种对数期启动的质粒表达载体。重组菌进行培养的过程中，只有进入对数期以后，且在稳定期之前，质粒上携带的目的基因才表达。利用本发明专利技术表达系统表达了角蛋白酶基因(ker)，通过发酵培养，与利用传统的强启动系统相比，菌体浓度和角蛋白酶活分别提高10.4～15.2％和27.8～41.5％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌对数期表达系统，属于基因工程领域。
技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)由于具有生长速度快、发酵周期短、胞外分泌蛋白能力强等特点，正在为应用生物学发挥着重要的作用。同时作为研究透彻模式菌株又是被普遍认为是安全的(GRAS)，已广泛应用于食品和药品的研究和生产中。但是，利用枯草芽孢杆菌过量表达途径基因某些代谢产物时，在对数期，前体合成基因的表达会促进前体的积累来提高产量。而进入稳定期后由于能量的限制，这些前体合成基因的表达反而会造成浪费，使产量降低。另外在表达一些酶制剂时，例如蛋白酶等，这类酶分子的在对数期的过量合成会使胞外有机氮源的分解更加迅速，有助于菌体的快速生长和缩短发酵时间。因此，通过调控启动子在不同生长时期的表达具有重要的现实意义。目前，研究者主要是通过添加诱导剂的方式来实现调控目的基因在不同时期的区别表达，而这类方法具有添加时期确定复杂、成本增加，且难以实现前期表达而稳定期不表达等缺点。对数期启动子是指只在菌体处于生长周期中的对数期才具有启动目的基因转录和表达能力的启动子。构建一种依托于草芽孢杆菌对数期启动子的自调控对数期表达系统具有很好的应用前景。
技术实现思路
为了满足目前利用枯草芽孢杆菌生产代谢产物和酶制剂等过程中需要在对数期特异表达某些基因的需求，本专利技术提供了三个对数期启动子以及一种枯草芽孢杆菌对数期期表达系统，并将其应用至蛋白分子的表达和代谢产物的生产。本专利技术的第一个目的是提供一种携带对数期启动子的质粒，是将质粒原有的用于表达目的基因的启动子替换为对数期启动的启动子；所述对数期启动的启动子包括Phag、PabrB和PvalS；其序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；用于构建所述质粒的出发质粒是pP43NMK、pUB110、pC194、pE194或在上述质粒基础上改造后的质粒。本专利技术的第二个目的是提供一种枯草芽孢杆菌对数期表达系统，所述表达系统是含有所述携带对数期启动子的质粒的枯草芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述携带对数期启动子的质粒是连接有Phag、PabrB和PvalS，中至少一种启动子的pP43NMK、pUB110、pC194、pE194或在上述质粒基础上改造后的质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为不含卡那霉素抗性的Bacillus subtilis168或Bacillus subtilis WB600。本专利技术的第三个目的是提供一种枯草芽孢杆菌对数期表达系统的构建方法，所述方法是构建携带有对数期启动子的质粒作为表达载体，并转入不含卡那霉素抗性的枯草芽孢杆菌中。在一般培养条件下，菌体生长进入对数期以后，该表达载体上的目的基因开始表达，进入稳定期后，目的基因停止表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将枯草芽孢杆菌对数期启动的组成型启动子与载体进行连接，构建重组载体，再将重组载体转入宿主中。在本专利技术的一种实施方式中，所述对数期启动的组成型启动子包括Phag、PabrB和PvalS，其序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体包括pP43，pP43NMK、pUB110、pC194、pE194或在上述质粒基础上改造后的质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：1.构建携带有对数期启动子的质粒：以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR获得对数期启动的启动子的DNA片段，通过酶切连接的方式替换掉质粒上用于表达目的基因的原有的启动子，转化入相应的构建宿主，获得携带有对数期启动子的质粒；所述表达质粒是：pP43NMK、pUB110、pC194、pE194或由这几种质粒改造后的质粒。2.将携带对数期启动子的质粒转化至不含有相应抗性基因的枯草芽孢杆菌宿主中，在相应的抗性条件下筛选，获得枯草芽孢杆菌对数期表达系统。所述枯草芽孢杆菌宿主包括：Bacillus subtilis 168，Bacillus subtilis 131.1，Bacillus subtilis AG1839，Bacillus subtilis PY79，Bacillus subtilis BAB-1，Bacillus subtilis XF-1，该表达系统的有效性的验证是以枯草芽孢杆菌中应用最为广泛的P43启动子以与对数期启动子相同的方式构建而成的传统表达系统作为对照的，通过与对照比较基因表达情况来验证有效性。其中步骤1中携带有对数期启动子的质粒的具体构建方法如下：(1)对数期启动子DNA片段的获得：以Bacillus subtilis 168(Bacillus subtilis 168，获取自美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心)基因组模板，PCR扩增Bacillus subtilis 168基因组上Phag、PabrB和PvalS启动子DNA片段；所述Phag、PabrB和PvalS的序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。(2)将Phag、PabrB和PvalS启动子DNA片段通过双酶切后，分别与相同酶切处理过的pP43质粒进行连接，之后转入Escherichia coli JM109中，通过氨苄青霉素平板筛选和质粒测序验证，分别得到携带有Phag的质粒pPHAG、携带有PabrB的质粒pPABRB和携带有PvalS的质粒pPVALS。该表达系统有效性的验证，可以选用各种外源基因进行表达验证，以角蛋白酶为例，验证方法如下：(1)菌株构建：以地衣芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增ker基因片段，连接到pP43和PyqfD上，构成新的质粒pP43-ker和pPHAG-ker。将新构建的两个质粒分别转入到Bacillus subtilis 168中。(2)筛选含有Bacillus subtilis 168(pP43-ker)和Bacillus subtilis 168(pPHAG-ker)的菌株。(3)酶活比较：将两株菌在发酵培养基中发酵培养，测定菌体浓度和角蛋白酶活性，比较菌体量和酶活大小。Bacillus subtilis 168(pPHAG-ker)中菌体生长更好，且角质酶酶活更高，说明该表达系统有效。本专利技术的第四个目的是提供一种枯草芽孢杆菌对数期表达目的基因的方法，将目的基因与权利要求1所述的质粒连接，再转入枯草芽孢杆菌中进行表达。本专利技术的第五个目的是提供所述枯草芽孢杆菌对数期表达系统在蛋白合成和代谢产物生产方面的应用。有益效果：本专利技术首次筛选获得了枯草芽孢杆菌对数期启动的启动子Phag、PabrB和PvalS，并将其用于构建枯草芽孢杆菌对数期表达系统，可以使重组枯草芽孢杆菌只有在进入对数期以后，且在稳定期之前，质粒上携带的目的基因才能表达。实验表明，本专利技术的pPHAG、pPABRB和pPVALS表达系统表达角蛋白酶基因(ker)的效果与传统前启动系统相比，菌体浓度和角蛋白酶活分别提高15.2％和41.5％，13.2％和36.7％，10.4％和27.8％。具体实施方式菌株的培养方法：种子培养基(L)：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠。发酵培养基(L)：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种质粒，其特征在于，是将质粒原有的用于表达目的基因的启动子替换为对数期启动的启动子；所述对数期启动的启动子包括Phag、PabrB和PvalS；其序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；用于构建所述质粒的出发质粒是pP43NMK、pUB110、pC194、pE194或在上述质粒基础上改造后的质粒。

【技术特征摘要】
1.一种质粒，其特征在于，是将质粒原有的用于表达目的基因的启动子替换为对数期启动的启动子；所述对数期启动的启动子包括Phag、PabrB和PvalS；其序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；用于构建所述质粒的出发质粒是pP43NMK、pUB110、pC194、pE194或在上述质粒基础上改造后的质粒。2.含有权利要求1所述质粒的枯草芽孢杆菌。3.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为不含卡那霉素抗性的Bacillus subtilis 168或Bacillus subtilis WB600。4.一种枯草芽孢杆菌对数期表达系统的构建方法，其特征在于，是构建权利要求3所述的枯草...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，杨森，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32